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【背景】人游离皮瓣移植越来越广泛应用于修复严重创伤和肿瘤等造成的皮肤软组织缺损,目前游离皮瓣的存活率仍然只有95%。以往的研究认为影响皮瓣存活的因素很多,其中皮瓣缺血再灌注损伤是影响皮瓣的存活的一个重要的因素。确保游离皮瓣完全存活,提高皮瓣存活率是整形医生首要目标。研究者们发现通过药理学和机械的干预能够减轻再灌注损伤,但是药物干预在临床上的运用仍然受到限制。“缺血后处理”为长期缺血后以及再灌注之前进行的一系列的机械重复周期短暂的再灌注和再阻断血流循环。目前,缺血后处理的保护作用已经在家兔、大鼠的游离皮瓣得到证实;但是还未有人的皮瓣相关的研究,并且后处理的保护作用研究机制并不清楚。本研究是想通过建立人皮瓣微血管内皮细胞低氧后处理模型,模拟在体的缺血后处理,研究缺血后处理的保护作用,为具体的机制研究奠定基础。【目的】参考国内外皮瓣真皮微血管内皮细胞提取方法,采用酶消化加磁珠分选的方法提取人皮瓣微血管内皮细胞。确定低氧后处理的最佳的缺氧和复氧时间,建立低氧后处理模型。【方法】采用酶消化联合磁珠分选法得到人真皮微血管内皮细胞(HDMECs),体外培养传至P5代,采用Ⅷ因子免疫荧光及CD309、CD34流式细胞学进行鉴定;检测乳酸脱氢酶(LDH)在随缺氧时间含量的变化;Tunel法染色计算各组的细胞凋亡率;用Western Blot的方法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3以及活化Caspase-3的蛋白含量表达。【结果】1.细胞分离培养4d后,可见散在的细胞集落,周边有成纤维状细胞生长,细胞集落,生长7d后,可见细胞呈铺路石样排列;2.经第2次分选,可见细胞呈紧密排列的漩窝状或同心圆状外观,呈铺路石样排列。第二次CD31磁珠分选后阳性率>95%;3.二次CD31磁珠分选后流式细胞鉴定结果:CD309阳性率为(95.4±1.34)%;CD34阳性率为(42.5±3.23)%;4.免疫荧光检测上清液中LDH:结果LDH随着缺氧时间的增加而加,8h与0h、2h、4h、6h相比LDH含量显著增加p<0.05,8h与12h差异性不显著p>0.05;5.Tunel和Western结果显示2min*3s和5min*3s的缺氧后处理(hypoxic postconditioning,H-post C)能够起到保护作用;【结论】1.根据细胞的集落形态以及免疫荧光和流式的结果分析得出,消化酶加CD31磁珠分选真皮微血管内皮细胞(HDECMs)的办法稳定可靠;2.根据乳酸脱氢酶(LDH)随缺氧时间变化的结果,确定最佳的缺氧时间;3.通过Tunel凋亡染色检测细胞凋亡比率;蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测Bax、Bcl-2和活化的Caspase-3、Caspase-3蛋白含量的表达,建立了人真皮微血管内皮细胞的低氧后处理模型,其中2min*3s和5min*3s是最好的后处理循环次数和持续时间。【讨论】本研究成功的采用CD31磁珠分选的方法提取并培养了HDMECs,采用Ⅷ因子免疫荧光进行鉴定,初步证实为HDMECs;同时采用CD34和CD309流式抗体检测细胞的生物学特征,这样能更方便我们在体外研究HDMECS的生理和病理生理特征。根据WB和Tunel结果分析我们同样发现,单纯低氧8h/复氧24h,活化的caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2以及细胞凋亡的比例高于其他组。并且2min*3s和5min*3s的缺氧后处理能够抑制细胞凋亡,但是在10min*3s、20min*3s缺氧后处理并不能达到理想的保护作用。因此我们推测在皮瓣微血管内皮细胞中,适当的后处理时间能够通过降低Bax/Bcl-2,活化的caspase-3/caspase-3的比例,达到抑制细胞凋亡的作用。所以说我们成功的建立了人真皮微血管内皮细胞的低氧后处理模型。