阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)是一种常见于老年人的中枢神经系统退行性疾病，常伴有广泛的海马和新皮质神经元和突触的丢失。现在大多数学说都认为神经元的丢失是由神经元的凋亡所引起。另外，神经元的异常衰老也和AD的发病有着一定的联系。 细胞的衰老与死亡与染色体末端的端粒(telomere)有关。端粒是染色体稳定、细胞生存所必需。端粒的结构、长短及其位置决定着细胞的生存状态，被誉为“有丝分裂的生物钟”。端粒酶(telomerase)是细胞核内一种核糖核蛋白逆转录酶，端粒酶复合物能以自身RNA为模板，在其催化亚基TERT的催化下合成端粒的DNA重复序列，以延长端粒长度，从而延长细胞的生命，被称为细胞的“永生化”。 在神经系统，由于终末分化的成熟神经元退出了细胞分裂周期，并不需要通过端粒酶延长端粒的长度来维持细胞的生命，所以对神经元内端粒酶表达的研究很少。而且，一般对神经元内端粒酶活性有关的研究都是采用啮齿动物模型，但啮齿动物其神经元成熟后，在出生后一段时期内仍具有端粒酶活性，与成熟后在胚胎早期即无端粒酶活性的人类神经元大有不同。本研究通过构建带有hTERT基因的腺病毒载体，将hTERT基因导入人类胚胎神经元，观察其对神经元生存和凋亡的影响，从而为预防和治疗AD的药物的开发提供方便。 目的：制备携带hTERT基因的pSU-CMV-hTERT腺病毒，将其转染人胚胎神经元，观察hTERT在神经元内的表达情况。并观察基因转染后对神经元生长活力和凋亡的影响。 方法：以pCI-neo-hTERT质粒为模板，设计引物，PCR法获取目的基因；将目的基因定向克隆到pSU-CMV穿梭质粒得到重组穿梭质粒pSU-CMV-hTERT，酶切鉴定；将pSU-CMV-TERT质粒与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine2000共转染至293细胞进行重组，并在293细胞内包装、扩增，经过病毒纯化后，得到经酶切鉴定正确的pSU-CMV-hTERT非增殖型腺病毒。取3月龄左右引产人胚胎，体外培养皮质及海马神经元。将病毒以最佳感染复数(MOI)感染人胚胎神经元，设立对照病毒组观察感染情况。免疫细胞化学荧光染色的方法观察神经元内hTERT的表达情况。分别取接种病毒后24h、72h、1周、2周、3周的神经元进行MTT法测量其细胞活力。设对照病毒组，并算出每个时间点hTERT转染后对神经元的保护率。用TUNEL法检测神经元凋亡情况。荧光显微镜下分析其结果。 结果：重组穿梭质粒pSU-CMV-hTERT经酶切鉴定正确，并与骨架质粒正确重组，经包装扩增后得到非增殖型腺病毒，命名为pSU-CMV-hTERT腺病毒。3月龄人胚胎皮质及海马神经元生长较好，在病毒转染后24h时神经元内已有病毒表达，在24h、72h、1周、2周末时，免疫细胞化学荧光染色方法可以看到神经元内有hTERT的表达，到第3周末时表达减弱。hTERT基因转染后的神经元其平均细胞活力较对照病毒组高，但在第3周末时两组细胞活力差别没有统计学意义。转染病毒后24h、72h、1周、2周、3周，hTERT基因转染对神经元的保护率分别为27.4％、42.4％、17.3％、7.4％和15.9％。TUNEL法检测细胞凋亡，荧光显微镜下观察到实验组病毒转染后24h、72h、1周、2周，神经元凋亡较对照组相应时间点明显减少，在转染后3周时差异不明显。高倍(200×)镜下各时间点实验组比对照组荧光率分别减少52％、59％、32％、28％、6.5％(图15)。 结论：1、构建pSU-CMV-hTERT腺病毒，对人胚胎皮质神经元进行感染。结果发现，该病毒对神经元有很好的感染力，目的基因表达较好。2、hTERT基因转染人胚胎皮质神经元后，较感染未带有hTERT基因的对照病毒组而言，实验病毒组的细胞活力增强。说明hTERT基因转染对人胚胎皮质神经元有一定的保护作用。在第3天时，病毒转染对神经元的保护作用最强。在第3周末时，实验组和对照组细胞活力无明显差异。 3、hTERT基因转染人胚胎皮质神经元后，神经元对凋亡的抵抗性增强，较感染未带有hTERT基因的空对照病毒组而言，实验组的凋亡程度减轻。第3周末时，实验组与对照组的凋亡程度差别不明显。