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本试验以龙血树幼嫩茎段为材料,通过对龙血树幼嫩茎段两步培养法再生的研究,建立了龙血树幼嫩茎段离体再生体系,证明了愈伤组织的发生和激素种类与浓度的关系;并在此基础上研究了愈伤组织再生对不同人工诱变方法(60Co辐射、EMS、秋水仙素)的反应、被处理愈伤组织再生能力和再生植株性状多样性、以及再生植株不同生理角度(外观性状、细胞学)的变异性,得到了2株变异株系。并从龙血树商业种植苗圃里选择出11种变异类型。
(1)首次对海南龙血树进行了种质创新途径的研究,田间自然变异的选择是目前最为有效的途径,组织培养分别培结合EMS、60Co辐射和秋水仙的诱变途径也是有效果的。田间实生群体自然变异可高达20%,已发现有11中种变异类型,其中LXZ09类型的变异率高达8%。EMS诱变途径中,浓度为2.0%的获得最高的微核率(15.6‰),EMS浓度为2.0%处理时间为4h的组合使材料达到半致死;细胞学的观察看到了单微核、双微核、三微核、染色体桥、滞留染色体和合胞体等染色体畸变现象,再生苗中发现了1棵变异株。60Co辐射的诱变途径中,20Gy的剂量使不定芽半致死,再生苗中发现了1棵变异株。秋水仙素诱导多倍体途径中秋水仙素浓度0.5%,处理时间5d的处理组合能获得较高的多倍率,多倍率为25%。
(2)首次获得了海南龙血树新种质13份,并较为系统地对11份自然变异的种质进行了植物学性状观察,其中6份材料具有成为龙血树新品种的潜力。这11份资源中,LXS01、LXS02、LXS03、LXS04、LXS06、LXS07这几份材料具有成为龙血树新品种的潜力。
(3)首次鉴定了海南龙血树的染色体数目,构建了海南龙血树根尖体细胞染色体制片技术。其技术要点是于上午9时~10时采集根尖,用饱和的对二氯苯预处理6h,固定4~18h,置于1mol/L稀盐酸在60℃恒温水浴酸化6min,置载玻片切片后用改良石炭酸品红染色30min,敲片后显微观察。鉴定了海南龙血树染色体数目(2n=42)。
(4)初步构建了基于组织培养的海南龙血树诱变复合技术体系。再生体系技术要点是愈伤组织的诱导培养基为MS+6-BA6.0mg/L+NAA0.5mg/L,诱导率可达62%;增殖培养基为MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L,经4周培养,愈伤组织增殖率可达9.6;分化培养基为MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.1mg/L;生根培养基是MS+NAA0.3mg/L+AC1g/L,生根率为100%。再生体系结合EMS复合技术体系的要点是浓度为2.0%的EMS处理生长旺盛的愈伤组织时间为4h,后进行分化和生根培养。再生体系结合60Co辐射复合技术体系的要点是20Gy的剂量辐射生长旺盛的愈伤组织,后进行分化和生根培养。再生体系结合秋水仙素复合技术体系的要点是浓度为0.5%的秋水仙素处理生长旺盛的愈伤组织时间为5d,后进行分化和生根培养。