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以水生动物作为受试动物来评价药物的毒性效应近年来已逐步成为国际上环境科学与水域生态学领域的研究热点。轮虫是浮游动物的主要类群之一,以其繁殖速度快、生活周期短和对毒物敏感性高的优点而经常应用于生态毒理学研究中。百草枯(Paraquat)是一种有机杂环类除草剂,胡桃醌(Juglone)是一种从核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)或者核桃(Juglans regia L)中提取出的萘醌类物质,这两种药物都能诱导机体形成过量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),从而产生氧化毒性效应。本文选用两种不同特性的轮虫作为试验材料——一种是目前研究已相对比较广泛的萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus),另一种是具有特殊生活史和表型多态性的卜氏晶囊轮虫(Asplachna brightwelli)考察两者对百草枯和胡桃醌的敏感程度,并探究两种药物的作用机理。在此基础上,本文还通过cDNA末端快速克隆(RACE,rapid-amplification of cDNA ends)技术克隆出卜氏晶囊轮虫的hsp70基因全长,并在此基础上,利用Real-time quantitative PCR比较了百草枯和胡桃醌对萼花臂尾轮虫和卜氏晶囊轮虫hsp70mRNA表达的影响。本试验从传统生态学和分子生态学两方面对这两种轮虫作为毒理学受试动物的情况进行综合探讨和比较,探究卜氏晶囊轮虫作为潜在环境毒理学评价模式动物的可行性,并探讨HSP70在轮虫抵抗氧化损伤方面的作用。本论文的研究内容主要涉及以下4个方面:1.百草枯、胡桃醌对萼花臂尾轮虫和卜氏晶囊轮虫的急性毒理效应采用单“克隆”培养的方法对萼花臂尾轮虫和卜氏晶囊轮虫分别进行急性毒理试验。萼花臂尾轮虫的急性毒理试验中,百草枯处理24h后,萼花臂尾轮虫的死亡率随药物浓度增大而升高,百草枯对萼花臂尾轮虫的24h-LC50为49.1588mg/L,直线回归方程为 Y=7.7928X-8.1824(R2=0.9739),95%置信限为 43.3978～55.6846 mg/L。晶囊轮虫的急性毒理试验显示,卜氏晶囊轮虫对百草枯的毒性效应十分敏感,百草枯对卜氏晶囊轮虫的 24h-LC50为 22.0874mg/L,直线回归方程为 Y=4.9927X-1.7108(R2=0.9263),95%置信限为 16.3690～29.8034 mg/L。胡桃醌对萼花臂尾轮虫也具有很强的毒性效应。胡桃醌对萼花臂尾轮虫的急性毒理试验显示,胡桃醌处理24h后,其死亡率随胡桃醌浓度增加而升高。胡桃醌对萼花臂尾轮虫的 24h-LC50为196.3306μg/L,直线回归方程为 Y=7.7157X-12.692(R2=0.9647),95%置信限为171.1099～225.2688μg/L。胡桃醌对卜氏晶囊轮虫的急性毒理试验显示,胡桃醌对卜氏晶囊轮虫的24h-LC50为92.5658μg/L,直线回归方程为Y=8.1195X-10.967(R2=0.9739),95%置信限为 82.3666～104.0279μg/L。2.百草枯、胡桃醌对萼花臂尾轮虫和卜氏晶囊轮虫的生长发育各阶段历时的影响不同浓度百草枯、胡桃醌对萼花臂尾轮虫和卜氏晶囊轮虫生长发育各阶段历时具有明显的影响。随着百草枯处理浓度的升高,萼花臂尾轮虫与卜氏晶囊轮虫生命周期各主要发育阶段历时的变化趋势大体相似。萼花臂尾轮虫的生殖前期大致均呈不断延长的趋势,萼花臂尾轮虫生殖后期的总体趋势为先缩短后延长,而生殖期、平均寿命和产卵量均逐渐缩短,卜氏晶囊轮虫无明显变化趋势。萼花臂尾轮虫的生殖前期在高浓度的百草枯(5、10mg/L)中较对照组显著延长(P<0.05),而生殖期则在所有百草枯处理组均发生显著缩短(P<0.05),但生殖后期的变化并不十分显著。萼花臂尾轮虫的平均寿命和产卵量在较高浓度的百草枯(2.5、5、10mg/L)中显著缩短和减少(P<0.05)。卜氏晶囊轮虫的生殖前期在较高浓度的百草枯组(2.5、5、10mg/L)中较对照组显著延长(P<0.05),而其生殖期、平均寿命和产卵量在所有浓度的百草枯处理组中均显著缩短和减少(P<0.05),其生殖后期在1.25和10mg/L的百草枯浓度组中明显缩短(P<0.05)。胡桃醌处理下萼花臂尾轮虫和卜氏晶囊轮虫各阶段历时的变化趋势大致相似。随着胡桃醌处理浓度的增大,萼花臂尾轮虫和卜氏晶囊轮虫的生殖前期总体均呈先延长后缩短的趋势,生殖期、平均寿命和产卵量总体呈逐渐缩短的趋势。萼花臂尾轮虫的生殖前期在12.5和25μg/L的胡桃醌浓度组中明显延长(P<0.05),其生殖期在12.5、25、50μg/L的胡桃醌浓度组中均显著缩短(P<0.05),生殖后期的变化没有一定规律,只有最高浓度组(50μg/L)处理时,其较对照组显著缩短(P<0.05)。胡桃醌的处理浓度为25、50μg/L时萼花臂尾轮虫的平均寿命较对照组大大缩短(P<0.05)。所有处理浓度的胡桃醌均可使萼花臂尾轮虫的产卵量明显减少(P<0.05)。胡桃醌浓度为6.25μg/L时,卜氏晶囊轮虫生殖前期在显著延长,相反50μg/L胡桃醌使其显著缩短(P<0.05),卜氏晶囊轮虫的生殖期在所有胡桃醌处理浓度组中均显著缩短(P<0.05),其生殖后期只在25μg/L胡桃醌处理组中显著缩短。较高浓度的胡桃醌(12.5、25、50μg/L)可使卜氏晶囊轮虫的平均寿命和产卵量显著缩短和减少(P<0.05)。3.卜氏晶囊轮虫hsp 70基因的克隆及其结构、功能研究根据其他物种的hsp70基因序列,通过同源比对找到各自基因的保守区,设计兼并引物,PCR扩增片段经NCBI BLAST确认后,利用RACE技术扩增出全长,最终得到了卜氏晶囊轮虫hsp70基因序列。卜氏晶囊轮虫Asphsp70基因全长2134bp,5’端和3’端分别含有80bp和125bp的非编码区,开放阅读框ORF为2069bp,编码642个氨基酸和一个终止密码子TAA。3’端非编码区含有一个多聚腺苷酸加尾信号(Polyadenylation Signal Site AATAAA)和 polyA 尾。翻译的蛋白分子量为70.2337kDa,理论等电点为5.84。未发现存在信号肽序列,说明卜氏晶囊轮虫HSP70是一种胞内蛋白。全长在NCBI同源比对显示其属于hsp70基因家族。通过氨基酸序列比对发现Asphsp70和小鼠M.musculus(BAE41082)氨基酸序列和的相似度最高,达到87%,HSP70的N端比C端更保守。4.百草枯、胡桃醌对萼花臂尾轮虫和卜氏晶囊轮虫hsp70基因表达的影响研究利用实时定量PCR测定百草枯对萼花臂尾轮虫hsp70的mRNA表达量的影响情况,试验结果显示,除了 1.25mg/L组处理1h、2.5mg/L组处理6h和5mg/L处理12h之外,其余各处理组大多都能使萼花臂尾轮虫hsp70的mRNA表达量显著提高(P<0.05)。百草枯处理卜氏昌囊轮虫的RT-PCR结果显示:短时间处理会使卜氏晶囊轮虫hsp70的mRNA表达量大大增加,经1.25、2.5、5、10mg/L的百草枯处理1h后,卜氏晶囊轮虫hsp70的mRNA表达量均发生显著增加(P<0.05)。另外,2.5mg/L百草枯处理3h和6h,10mg/L处理3h,卜氏晶囊轮虫hsp70的mRNA表达量也显著增加(P<0.05)。随着处理时间的延长,卜氏晶囊轮虫hsp70的mRNA表达量逐步回落。胡桃醌处理萼花臂尾轮虫的试验中,6.25、12.5μg/L浓度组处理6h、12h后,萼花臂尾轮虫hsp70的mRNA表达量显著增加(P<0.05),25、50μg/L浓度组处理1h、3h和6h后,萼花臂尾轮虫hsp70的mRNA表达量也显著增加(P<0.05)。胡桃醌12.5、25、50μg/L浓度组处理卜氏晶囊轮虫1h后,卜氏晶囊轮虫hsp70的mRNA表达量均发生显著增加(P<0.05),之后随着处理时间的延长,又有回落的趋势。除25μg/L胡桃醌处理6h组,卜氏晶囊轮虫hsp70的mRNA表达量较对照组显著提高外(P<0.05),其余各组未见明显变化。另外,在6.25μg/L浓度组,卜氏晶囊轮虫hsp70的mRNA表达量不受处理时间影响,均发生显著增加(P<0.05)。