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目的前列腺癌是最常见的男性泌尿生殖系统恶性肿瘤之一,其发病率及致死率在我国逐年增加。我们前期研究发现c-myc及GPC5的异常表达与前列腺癌的进展密切相关;并且c-Myc能够抑制GPC5的表达,然而其具体机制尚不明确;相关研究表明HDGF在前列腺癌中异常高表达,并且我们前期发现GPC5能够靶向抑制HDGF,但是其具体机制亦不明确。本文旨在通过运用生物信息学及相关分子生物学方法深入探究c-Myc-GPC5/HDGF通路在前列腺癌发生发展过程中作用及分子机制,为揭示前列腺癌的发生发展及探索其有效的靶向诊疗新手段提供科学依据。方法1.通过生物信息学技术针对GPC5启动子区域序列进行分析,发现GPC5转录起始位点上游存在特殊的c-Myc转录结合E-Box盒序列,我们构建了含有GPC5 E-Box序列的pGL3报告基因质粒并且利用双荧光素酶报告基因进行验证,用Chip实验进一步确定其具体的结合位点;利用MTT实验验证c-Myc能够通过抑制GPC5调节细胞增殖。2.DNA甲基化也是c-Myc非常重要的转录调节机制之一,我们通过CpG岛网络预测数据库发现GPC5启动子及第一外显子区域存在2个CpG区域,并且用DNA甲基化抑制剂及qMSP实验验证GPC5的具体甲基化情况;构建高表达c-Myc质粒,设计针对DNA甲基转移酶1、3a、3b的SiRNA及其阴性对照序列,利用外源性转染技术,改变前列腺癌细胞中c-Myc及DNA甲基转移酶的表达,通过RT-qPCR、Western blot、qMSP、CO-IP方法检测c-Myc具体通过甲基化调节GPC5的机制。3.前列腺癌中c-Myc可转录调节miR-17-92簇的异常表达,我们通过网络数据库预测发现GPC5基因的3`UTR区存在miR-19b-1的作用位点,我们推测c-Myc调节GPC5异常表达的过程中,miR-17-92簇可能也发挥重要作用。然后我们利用Affymetrix miRNA芯片检测了miR-17-92簇在前列腺癌中的异常表达情况,用RT-qPCR技术验证了miR-19b-1在组织及前列腺癌细胞系中的表达情况;通过luciferase报告基因实验验证miR-19b-1对GPC5的抑制效应,利用MTT实验验证miR-19b-1通过调节GPC5影响细胞增殖。4.最后我们对GPC5的下游相关蛋白调节机制进行了初步探讨,前期我们研究发现GPC5能够抑制下游HDGF的表达,外源性转染高表达GPC5质粒后,利用confocal、核质分离、Western Blot实验发现GPC5能够抑制HDGF,尤其是前列腺癌细胞核中HDGF的表达;GPC5作为一种膜蛋白如何影响HDGF的细胞核的表达呢,在此我们引入了一种非常重要的具有运输作用的细胞器:外泌体。首先,通过超高速离心法提取前列腺癌细胞系的外泌体,并利用透射电镜、NTA技术对其进行鉴定,然后利用WB技术,验证外泌体中是否含有HDGF;用提取的外泌体处理前列腺癌PC3细胞,通过confocal、核质分离、Western Blot技术验证外泌体能否把HDGF运输到细胞核,然后外源性高表达GPC5或加入低分子肝素(HS模拟物),通过confocal验证GPC5能否通过其HS链抑制外泌体的对HDGF的运输作用。结果1.c-Myc能够通过结合GPC5启动子区域的2个E-Box结合位点转录抑制GPC5的表达,从而影响前列腺癌的细胞增殖。2.c-Myc能够通过招募DNMT3b改变GPC5的甲基化状态,从而抑制GPC5的表达。3.miR-19b-1在前列腺癌中高表达,并且c-Myc能够通过miR-19b-1靶向结合GPC5的3’UTR,抑制GPC5的表达。4.外泌体可以携带HDGF进入前列腺癌细胞及细胞核,GPC5可以通过其特殊的HS链结构抑制外泌体对HDGF的运输作用。结论前列腺癌中c-Myc可以通过直接或间接途径抑制GPC5的表达,而GPC5可以通过其HS链抑制外泌体对其下游HDGF的运输,因此,靶向c-Myc—GPC5/HDGF通路可能是控制前列腺癌进展的非常好的潜在方向。