小分子酸改性啤酒废酵母对蛋白质吸附性能的研究

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蛋白质在生物体的形成、生长和发育的过程中有着极其重要作用。随着现代科学的发展和人类需求的增长,科学研究和临床实验对纯度高和质量好的蛋白需求越来越大。但由于生命物质的特殊性,能单一且稳定存在的蛋白质较少。所以需要用科学的方法分离、纯化蛋白质。用吸附的方法纯化和分离蛋白质,与其他的方法相比,操作简便、设备简单、处理时间短且成本低廉。研究开发新型的具有高选择性、高效率和经济实用的吸附剂,仍是如今科学研究领域的一个热点。啤酒废酵母菌是啤酒工业的废弃物,在处理工业废水中应用较广泛。通过对啤酒废酵母菌进行化学修饰,可以在其表面接枝具有特异吸附性的官能团。不仅实现了废物的再生利用,节省资源,而且能实现其在其它方面的价值。以下工作是把几种常见的小分子酸修饰到啤酒废酵母菌表面,制备成一批新的生物吸附剂,并以其为对象,用各种仪器和方法进行表征。探讨了合成的目标产物对以下三种常见蛋白质或酶(溶菌酶、牛血清白蛋白和牛血红蛋白)的吸附效果。具体工作如下:1、以NaH2PO4为催化剂,在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,用柠檬酸修饰交联度1%的啤酒废酵母菌,制备了一种新的吸附剂(简称修饰酵母菌)。用红外光谱(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)及表面氢离子含量的测定对产物进行了表征。用制备的吸附剂分离、纯化溶菌酶。考察了溶液的pH、温度、吸附时间、溶菌酶的初始浓度、NaCl离子强度等因素对吸附效果的影响。确定最佳吸附条件:吸附酸度pH7.4,吸附温度25℃,吸附时间40min。修饰酵母菌的最大吸附容量为954.7mg.g-1,未修饰酵母菌最大吸附容量为89.9mg.g-1,前者是后者的10.6倍。用该吸附剂从鸡蛋清处理液中提取溶菌酶,用1.0mol.L-1NaCl水溶液洗脱,洗脱率为84.8%,活力收得率为71.3%,纯化倍数27.5。鸡蛋清处理液和吸附提取后洗脱液的电泳结果表明,该法从鸡蛋清中富集溶菌酶效果明显,酶纯度高。修饰酵母菌重复使用三次,吸附率仅降低3%。用Langmuir和Freundich模型对吸附过程进行模拟,修饰酵母菌对溶菌酶的吸附能较好的符合Langmuir吸附模型。2、以吡啶为溶剂,将马来酸酐接枝到啤酒废酵母菌的表面,洗涤、烘干后,用饱和NaHCO3处理。制得马来酸酐修饰的啤酒废酵母菌吸附剂。在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,以尿素为介质,将磷酸修饰到啤酒废酵母菌的表面。并通过修饰前后重量的变化、红外光谱、X射线光电子能谱及H+含量的滴定,对交联菌和两种修饰菌进行表征。表征结果证明马来酸酐和磷酸成功的和酵母菌表面的-OH反应,合成了目标吸附剂。分别以两种合成的产物为吸附剂,溶菌酶为吸附对象进行吸附条件实验。实验结果表明,马来酸酐修饰菌对溶菌酶的吸附未得到明显改善,最大吸附容量和未修饰菌较接近,仅是为未修饰菌的1.3倍。有意义的是,溶液的酸度对磷酸修饰菌吸附溶菌酶的影响不大,吸附过程较快,20min能达到吸附平衡,最大吸附容量为1423.2mg.g-1,是未修饰菌(89.9mg.g-1)的15.8倍,以1.0mol.L-1pH7.0的NaCl溶液为洗脱液,洗脱率高达86.2%。将该吸附剂用于从鸡蛋清中提取溶菌酶,并对酶活力进行测定,总活力收得率为65.0%,纯化倍数为29.1。用两种吸附模型对吸附过程进行模拟,发现两种修饰菌均符合Langmuir模型。说明吸附剂对溶菌酶的吸附是单分子层吸附为主。3、以牛血清白蛋白为吸附对象,柠檬酸和马来酸酐修饰菌为吸附剂进行实验,结果发现柠檬酸修饰菌对牛血清白蛋白的最佳吸附条件为,吸附时间12h、吸附酸度pH4.0、吸附温度25℃,最大吸附容量为242.6mg.g-1,是未修饰菌(31.4mg.g1)的7.7倍。马来酸酐修饰啤酒废酵母菌对牛血清白蛋白的最佳吸附条件为吸附时间20h、吸附酸度pH6.6、吸附温度25℃,最大吸附容量为162.9mg.g-1,是未修饰菌(31.4mg.g1)的5.2倍。用Langmuir和Freundlich模型对柠檬酸修饰菌和马来酸酐修饰菌吸附等温线进行模拟,发现两种修饰菌对牛血清白蛋白的吸附过程更符合Langmuir吸附等温模式,表明牛血清白蛋白的吸附是以单分子层吸附为主。以0.5mol.L-1咪唑水溶液为洗脱液,洗脱柠檬酸吸附的牛血清白蛋白,一次洗脱率达到69.6%。4、将磷酸、柠檬酸、马来酸酐修饰啤酒废酵母菌用于吸附牛血红蛋白的研究,实验发现三种吸附剂的最佳酸度为pH5.0,磷酸修饰菌能在很短的时间内达到吸附平衡,柠檬酸修饰菌需要12h,马来酸酐修饰酵母菌对牛血红蛋白几乎不吸附。磷酸、柠檬酸修饰酵菌对牛血红蛋白的吸附容量较大。分别为309.8mg.g-1和369.8mg.g-1。与未修饰菌相比吸附容量有了很大的提高。
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