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菊花是我国的传统花卉,也是世界四大鲜切花之一,占切花总量的23%。由于菊花的传统育种方式是利用芽变(菊花雌雄性性器官退化)的方法来选育新品种,所以育种的速度慢,周期长,定向性差。利用基因工程技术,有目的地向菊花中导入一些基因,培育抗病性好、色香形独特、观赏价值高的菊花新品种,不但可以有目的地改良特定性状,还可以缩短育种年限和加快育种进程。本研究通过再生试验选择了两个品种(山城之光和日本小黄)来作为遗传转化的材料,山城之光为切花菊,日本小黄为小菊。所选用的外源基因为抑制叶片衰老的SAG-IPT基因,以期得到耐贮运、瓶插寿命长的切花菊山城之光和抗衰老、花期长的绿化小菊日本小黄。 1.建立了以幼叶和茎段为外植体的再生体系。 取植株刚展开的幼叶或幼茎,消毒后接入MS1(MS0+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA)中预培养2~6天后,转入MS2(MS0+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA)(幼叶)、MS3(MS0+3.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA)(茎段)后可直接再生出芽。其中,山城之光和日本小黄的幼叶经预培养后再生率可达100%,而白雪、光辉、冬青、白绣纺四个品种的再生率则较低,难以满足遗传转化的需要。日本小黄茎段再生率也达92%,山城之光再生率不足70%,其他品种的茎段再生率则极低。再生出的芽在1/2MS培养基上经7~10天可生根,生根率达100%。 2.建立了以幼叶为受体的遗传转化体系 取切花菊“山城之光”和小菊“日本小黄”的无菌苗叶片,切成4mm~2大小,以OD~600=0.5的农杆菌液感染30min,滤除菌液,接入MS1培养基上,于暗处共培养3天。共培养后,以附加有500mg/L的Cef和500mg/L的Carb的MS0液体培养基震荡脱菌培养2小时,无菌水冲洗5次,无菌滤纸吸干水分。然后接入MS2+50mg/L Cef的培养基上延迟筛选培养3天,再转入MS2+50mg/L Cef+5mg/LKm培养基上进行筛选分化培养。30天后可分化出绿芽,把分化出的绿芽在1/2MS0+10mg/L Km培养基上进行生根筛选,把能够正常生根的苗移栽田间,做进一步的鉴定。 3.通过PCR扩增表明,转基因植株中可以检测出有目的基因(ipt基因)的存在,目的基因已成功地插入菊花的基因组中。园艺性状观察表明,转基因植株和野生株存在有一定的差异。