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目的:瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)是肥胖等脂肪细胞代谢功能性疾病临床研究的一个热门靶点,在前脂肪细胞及脂肪细胞中均有表达,参与脂肪分化及褐化过程的调节。脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)作为体内脂肪细胞的重要来源,可定向分化为多种细胞,因其来源丰富,且不存在伦理问题限制,已成为组织工程和再生医学的热门种子细胞。最近有研究报道,TRPV1在人ADSCs上也有表达,但其生理学意义尚未阐明。为进一步阐明TRPV1对肥胖产生的作用,并为组织工程脂肪的构建和重建缺损的软组织提供新的研究思路。本研究在原代培养的大鼠ADSCs上确定TRPV1的表达和变化,并用经典的TRPV1激动剂辣椒素(Capsaicin,Cap)和拮抗剂辣椒平(Capsazepine,CAPZ),探究TRPV1对ADSCs增殖及白色和褐色成脂分化的影响。方法:(1)原代培养大鼠内脏脂肪源性干细胞(Visceral adipose Mesenchymal stem cells,V-ADSCs)和皮下脂肪源性干细胞(Subcutaneous adipose Mesenchymal stem cells,S-ADSCs),流式细胞术对ADSCs进行免疫表型鉴定,免疫荧光对3D细胞球进行多能性指标Nanog、Oct4、Sox2的检测,Western blotting检测TRPV1蛋白的表达。(2)探究Cap及CAPZ对ADSCs增殖的影响:(1)CCK-8检测辣椒素(TRPV1的经典激动剂,但长时间作用可使TRPV1脱敏)对内脏脂肪源性干细胞(Visceral adipose Mesenchymal stem cells,V-ADSCs)和皮下脂肪源性干细胞(Subcutaneous adipose Mesenchymal stem cells,S-ADSCs)细胞活力的量效(0.3μM,1μM,3μM,10μM,30μM,100μM)和时效(24,48,72h)作用。(2)二维(2D)和三维培养(3D)状态下比较Cap和CAPZ对ADSCs增殖的影响:分别用不同浓度的Cap(1μM,3μM,10μM)和CAPZ(1μM,3μM,10μM)孵育ADSCs与HUVECs,48h后CCK-8观察活细胞数量的变化,EdU检测增殖期细胞数量;采用琼脂糖“微模板法”建立稳定的ADSCs三维细胞球培养体系,Cap(3μM)和CAPZ(3μM)孵育ADSCs 48h后观察细胞球直径的变化。(3)探究TRPV1对S-ADSCs褐色成脂分化的影响:Western blotting检测褐色成脂分化过程中(0,2,5,8 day)TRPV1表达的情况;在褐色成脂诱导分化过程中,设置分组Con、Cap(1μM,3μM,10μM)、Cap(3μM)+CAPZ(10μM)、CAPZ(10μM),Western blotting检测褐色成脂标记蛋白UCP1的表达,尼罗红染色分析中性脂滴成脂率。(4)探究TRPV1对V-ADSCs白色成脂分化的影响:在白色成脂诱导分化过程中,设置分组Con、Cap(1μM,3μM,10μM)、Cap(3μM)+CAPZ(10μM)、CAPZ(10μM),q-PCR和Western blotting分别检测成脂分化转录基因PPAR-γ在ADSCs中,其mRNA和蛋白水平的表达情况,尼罗红中性脂滴染色分析成脂率。结果:(1)大鼠S-ADSCs和V-ADSCs均表达TRPV1。Cap对两个部位来源的ADSCs均有促增殖作用。CCK-8的检测结果显示:1,3,10μM Cap均可增强ADSCs的细胞活力,其中3μM Cap的作用最为显著。用3μM Cap处理内脏和皮下ADSCs不同时间,48h和72h的促增殖效果显著。(2)CCK-8和EdU显示,TRPV1拮抗剂CAPZ不仅不能取消Cap的促增殖效应,反而表现为比Cap更为显著的促ADSCs增殖效应,表现为活细胞数量的增加,及EdU阳性细胞比例升高。而对于相同条件培养的HUVECs,CAPZ则没有这种促增殖效应。(3)3D培养状态下,Cap和CAPZ孵育48 h均能增大ADSCs细胞球的直径,其中CAPZ的效应更为显著。(4)Western blotting结果显示,S-ADSCs诱导褐色成脂分化的过程中,TRPV1表达量无明显改变。Cap可显著促进S-ADSCs棕色成脂分化,表现为上调产热基因UCP1蛋白的表达,且使细胞中的中性脂滴的含量增加。CAPZ可取消Cap促进褐色成脂分化的作用。(5)Cap可显著促进V-ADSCs白色成脂分化,表现为剂量依赖性增加细胞中的中性脂滴的含量,并显著上调成脂基因PPAR-γ的蛋白和mRNA水平,而CAPZ可阻断Cap的效应,抑制白色成脂分化。结论:(1)大鼠的皮下和内脏ADSCs均表达TRPV1;(2)2D和3D状态下,CAPZ阻断TRPV1或Cap使其脱敏均可促进ADSCs增殖;(3)Cap激活TRPV1可促进ADSCs的褐色成脂分化和产热基因UCP-1的表达;(4)Cap促进ADSCs白色成脂分化,其机制与激活TRPV1上调成脂基因PPAR-γ的表达有关。