鹿茸是哺乳动物中极为特殊的骨质器官,它以惊人的生长速度发挥其周期性再生的能力,并且通过割茸创伤的无疤痕愈合,展现了其强大的免疫功能,使之成为各科研领域广为推崇的研究模型。鹿茸的发生与再生是多方面因素的合力所共同实现的,迄今为止,人们尚未能完全破解鹿茸发育的调控网络。转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)是一类多功能的生长因子,对细胞具有复杂的调控作用。已有研究表明,TGF-β及其受体在鹿茸顶端有大量表达,但其功能性研究却少有报道。因此,探究TGF-β在鹿茸快速生长阶段的重要作用成为本研究的主要目的。本研究利用生物信息学软件,对克隆得到的梅花鹿TGF-β1基因核苷酸序列及氨基酸序列相似性百分率、基因编码蛋白质的理化性质、翻译后修饰位点及蛋白质的二级结构进行了预测,通过免疫组化分析了TGF-β1在鹿茸顶端不同组织的相对表达强度,表明TGF-β1在软骨层中表达水平最高,其次为间充质层和真皮层。为探究TGF-β1在鹿茸软骨细胞中的功能,本试验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除鹿茸软骨细胞中的TGF-β1基因。首先,针对梅花鹿TGF-β1序列设计3条gRNA寡核苷酸序列,退火后,与线性化的pBOBI载体进行连接,以完成敲除载体的构建;然后,在293T细胞中,对阳性敲除载体进行慢病毒包装,使其能够高效进入软骨细胞;最后,通过Western blot筛选TGF-β1基因敲除的软骨细胞。获得鹿茸软骨细胞TGF-β1基因敲除细胞系以后,通过EdU试验检测基因敲除软骨细胞体外增殖的变化,细胞划痕试验检测基因敲除软骨细胞的体外迁移情况,PCR array试验检测基因敲除对软骨细胞中TGF-β信号通路相关基因表达的影响,并结合荧光定量PCR和Western blot对其部分结果进行验证。结果显示,TGF-β1的缺失,抑制了鹿茸软骨细胞的体外增殖,促进了软骨细胞的迁移,导致TGF-β及其相关通路中11个相关基因的上调和9个相关基因的下调,推测当TGF-β1介导的TGF-β通路功能丧失时,BMP4介导的BMP信号通路可能发挥重要作用。