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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是主要的中枢神经系统退行性疾病之一,其主要病理学特征是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元选择性死亡,以及残存的神经元内出现α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)的异常聚集,形成Lewy小体(Lewy bodies,LBs)。由于释放到纹状体(striatum,Str)的DA减少,造成基底神经节的直接通路和间接通路失衡,引起静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势反射障碍等临床表现。到目前为止,PD的病因尚未明确,遗传、环境、老龄化、氧化应激,炎症等因素均参与了PD黑质DA能神经元变性死亡的过程。Ghrelin作为一种内源性脑肠肽,是生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor,GHS-R)的唯一内源性配体,GHS-R主要有1a和1b两种亚型,其中1a亚型是其主要的功能性受体。在中枢神经系统,GHS-R1a主要分布在下丘脑、垂体、海马、中脑、黑质等部位,具有调节生长激素分泌,食物摄入、能量代谢及神经保护作用。本课题组前期研究发现,Ghrelin可以通过激活其受体GHS-R1a介导的细胞内信号转导过程,使黑质DA能神经元的兴奋性增加,从而导致纹状体的DA释放量增加和代谢率增高。Ghrelin还可以通过其受体激活的细胞内信号转导途径,通过抗氧化、抗炎和抗凋亡机制拮抗神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的黑质DA能神经元的损伤。并且在Ghrelin存在的条件下,外源性过表达GHS-R1a可以显著拮抗1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP+)诱导的黑质DA能神经元的损伤。以上结果提示,在PD中,Ghrelin能够通过与其受体GHS-R1a结合发挥神经保护作用。同时,也有研究指出,在没有天然配体Ghrelin存在的情况下,GHS-R1a也能够与多种G蛋白偶联受体发生二聚化形成异源二聚体,如多巴胺1型受体(dopamine type 1 receptor,D1R),多巴胺2型受体(dopamine type 2 receptor,D2R),黑皮质素3型受体(melanocortin-3 receptor,MC3R),血清素2C型受体(serotonin type 2C receptor,5-HT2C)和大麻素1型受体(cannabinoid type 1 receptor,CB1)等,进而通过激活细胞内信号转导过程发挥重要的生理功能。但是内源性GHS-R1a在PD中黑质DA能神经元损伤中的作用尚未见任何报道。为了探讨内源性GHS-R1a在PD中黑质DA能神经元损伤中的作用及其机制,本实验拟在Ghrelin受体敲除的小鼠(Ghsr+/-小鼠)上,给予MPTP腹腔注射,观察Ghrelin受体敲除对MPTP所致的小鼠黑质DA能神经元损伤的影响。实验分为四组,WT-NS组、WT-MPTP组、Ghsr+/--NS组以及Ghsr+/--MPTP组,分别给予腹腔注射MPTP或者NS 5 w,应用高效液相色谱技术(high-performance liquid chromatography,HPLC)观察Str区DA含量的变化;应用免疫荧光技术,观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞和小胶质细胞数量变化;应用Western blots技术检测黑质区TH、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的蛋白表达变化以及Bcl-2/Bax比值的变化,以期阐明内源性GHS-R1a在PD中黑质DA能神经元损伤中的作用。结果如下:1.MPTP注射1 w、3 w和5 w后,WT小鼠黑质区TH阳性细胞数量分别减少了16%、34%和48%,TH蛋白表达水平分别降低了26%、51%和44%,差别具有统计学意义(P<0.05)。而Ghsr+/-小鼠,MPTP注射1 w、3 w和5 w后,黑质区TH阳性细胞数量分别减少了40%、50%和58%,TH蛋白表达水平分别降低了42%、61%和74%,与对照组相比,差别具有统计学意义(P<0.05)。与WT-MPTP组小鼠相比,Ghsr+/--MPTP组小鼠黑质区TH阳性细胞的数量分别减少了33%、26%和30%,TH蛋白表达水平分别降低了21%、40%和59%,差别具有统计学意义(P<0.05)。2.MPTP注射5 w后,WT小鼠Str内DA含量由13.81±0.27 ng/mg降低至6.65±0.67ng/mg,与对照组相比,降低了51%,差别具有高度统计学意义(P<0.01)。而Ghsr+/-小鼠,MPTP注射5 w后,Str内DA含量由11.67±2.25 ng/mg降低至3.81±0.49ng/mg,与对照组相比,降低了67%,与WT-MPTP组小鼠相比,降低了42%,差别具有高度统计学意义(P<0.01)。3.MPTP注射5 w后,WT小鼠黑质区小胶质细胞数量增加了66%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义(P<0.001)。而Ghsr+/-小鼠,MPTP注射3w后,黑质区小胶质细胞数量即增加了60%,注射5 w后,增加了107%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义(P<0.001)。与WT-MPTP组小鼠相比,Ghsr+/--MPTP组小鼠黑质小胶质细胞数量在MPTP注射5 w后,增加了31%,差别具有高度统计学意义(P<0.001)。4.在MPTP注射5 w后,WT-MPTP小鼠黑质IL-6蛋白表达量上升了33%,而Ghsr+/--MPTP小鼠黑质IL-6蛋白表达量上升了65%,差别具有统计学意义(P<0.05)。与WT-MPTP小鼠对比,Ghsr+/--MPTP小鼠黑质区IL-6蛋白表达量增加了23%,差别具有统计学意义(P<0.05)。5.Western blots检测结果发现,在MPTP注射3 w和5 w后,WT小鼠黑质区SOD1蛋白表达量分别降低了29%和36%,而Ghsr+/-小鼠,在MPTP注射3 w和5 w后,黑质区SOD1蛋白表达量分别降低42%和63%,差别具有统计学意义(P<0.05)。与WT-MPTP小鼠对比,Ghsr+/--MPTP小鼠黑质SOD1蛋白表达量在MPTP注射5 w后减少了42%。6.WT小鼠在给药5 w后,黑质Bcl-2/Bax比值降低了30%,差别具有高度统计学意义(P<0.001),而Ghsr+/-小鼠在给药3 w后,黑质Bcl-2/Bax比值就降低了33%,5 w后降低了50%,差别具有统计学意义(P<0.05)。与WT-MPTP小鼠对比,Ghsr+/--MPTP小鼠黑质Bcl-2/Bax比值在MPTP注射5 w后降低34%,差别具有统计学意义(P<0.05)。综上所述,内源性GHS-R1a的缺失能够明显增强MPTP的神经毒性作用,在MPTP注射的早期,即出现中脑黑质DA能神经元的损伤,表现为TH阳性细胞数量的减少和TH蛋白表达水平的降低,其机制可能与Ghrelin受体敲除后,MPTP引起的小胶质细胞的激活,导致炎性反应增强,抗氧化应激能力减弱促进细胞凋亡所致。本研究表明,内源性GHS-R1a在黑质DA能神经元上具有重要的生理学意义,它的缺失会使黑质DA能神经元更容易受到神经毒素MPTP所致的损伤。