第一部分：马兜铃酸-I致比格犬肝急性炎症伴肿瘤祖细胞形成目的：明确马兜铃酸Ⅰ (Aristolochic acid Ⅰ, AA Ⅰ)致比格犬肝急性炎症中,炎症细胞因子白细胞介素-6 (Interleukin 6, IL-6)及炎症信号通路信号转导与转录激活子-3 (Signaling transducer and activator of transcription-3, STAT3),转录因子核因子-κB (Transcription factors nuclear factor-κB, NF-κB),探索急性炎症环境下是否存在肿瘤祖细胞发生。方法：健康成年比格犬8只,每组4只。实验组口服3 mg/kg/day AA I胶囊,对照组口服辅料胶囊；连续给药至第10天,并于第12天处死。苏木素-伊红(Hematoxylin & eosin, H&E)染色评价肝脏损伤状况并采用TUNEL染色检测肝细胞凋亡情况。通过ELISA及RT-PCR分别检测肝组织中IL-6释放水平及基因表达水平；采用免疫荧光,蛋白免疫印迹及免疫组织化学法检测IL-6下游炎症信号通路白细胞介素-6受体a (Interleukin 6 receptor a, IL-6Ra)/Janus酪氨酸激酶2(Janus tyrosine kinases 2, JAK2)/STAT3,激活蛋白1 (Activator protein 1, AP-1) /NF-κB炎症通路及转化生长因子-β (Transforming growth factor β, TGF-β)通路激活情况；通过免疫组化表型鉴定,蛋白检测及蛋白免疫共沉淀法检测肝前体细胞发生情况；采用激光共聚焦结合免疫荧光法鉴定肿瘤祖细胞标志。结果：AAI连续给药10天,H&E染色组织切片显示比格犬肝小叶紊乱,TUNEL免疫荧光染色呈现大量阳染细胞,提示肝细胞发生凋亡。肝组织中IL-6表达水平上调,其下游通路IL-6Ra/JAK2/STAT3处于激活状态；同时炎症相关核转录因子NF-κB也处于激活状态,说明AAI致比格犬肝损伤伴急性炎症发生,其炎症主要由炎症细胞因子IL-6及核转录因子NF-κB介导。免疫组化,免疫印迹及蛋白质免疫共沉淀法系统地评价了在炎症环境下,肝组织出现八聚体结合转录因子-4(Octamer-binding transcription factor-4, Oct4), STAT3阳染肝前体细胞,并伴有TGF-β1信号通路激活,推测急性炎症期TGF-β1通路激活有利于肝前体细胞增殖分化。通过组织免疫荧光染色法确定了表型为Oct4阳性,STAT3阳性,TGF-β1 Ⅱ型受体(TGF-β1 receptor Ⅱ, TBRⅡ)阴性,胚胎肝胞衬蛋白(Embryonic liver fodrin, ELF)阴性的肿瘤祖细胞,证实肿瘤祖细胞出现在AAI引发的肝急性炎症环境中。结论：AA I致比格犬肝急性损伤,可见肝细胞凋亡伴TGF-β1信号通路与IL-6/STAT3/NF-KB同时激活,出现"Oct4~+, STAT3~+伴TBRⅡ~-, ELF~-"特征的肿瘤祖细胞。第二部分：马兜铃酸-I致比格犬肝脏miRNome改变与肿瘤祖细胞形成的相关性目的：探索AAI致比格犬急性炎症伴肿瘤祖细胞发生过程miRNAs表达谱,明确miRNAs靶向转录后调控的分子事件。方法：采用Exiqon miRCURY LNATM芯片平台检测犬类miRNAs表达谱,生物信息学预测,并通过qRT-PCR法验证差异表达miRNAs：变化>1.5倍,P<0.05)。通过数据库(www.targetscan.org), (www.mirbase.org), (www.pubmed.com)推测miRNAs可能调控的靶基因,并通过蛋白免疫印迹法对其进行确认,采用激光共聚焦结合免疫荧光,检测恶性转化相关蛋白促癌蛋白Myc (Oncogenic transcription factor Myc, c-Myc)及癌胚RNA结合蛋白Lin28同源物B (Oncofetal RNA-binding protein Lin28 homolog B, Lin28B)表达情况。结果： AAI致肝组织中73个miRNAs变化大于1.5倍,其中cfa-miR-200c, cfa-miR-34a, cfa-miR-378, cfa-miR-223, cfa-miR-24, cfa-let-7b变化>1.5倍,P<0.05。通过生物信息学预测,qRT-PCR验证以上6个miRNAs及let-7a-1～let-7b簇,miR-27a-miR-24簇成员let-7a-1及miR-27a表达水平均呈现出不同程度差异表达(变化>1.5倍,P<0.05)。通过生物信息学数据库分析与预测,及蛋白免疫印迹验证,证明了以上miRNAs调控的10个靶蛋白表达均发生了不同程度改变,其中7个蛋白变化>1.5倍,P<0.05。值得引起关注的是,磷酸化叉头框01(Phospho-forkhead box O1, p-FOXO1)表达增加22倍,同时伴有c-Myc和Lin28B,高表达,提示恶性转化事件的发生可能与肿瘤祖细胞发生相关联。结论：AA I致比格犬肝脏炎性恶变过程中,miRNAs呈现差异表达谱,通过生物信息学预测和qRT-PCR验证结果揭示miRNAs let-7a-1, let-7b, miR-27a, miR-223, miR-200c, miR-24, miR-34a, miR-378差异显著,明显受调控的靶蛋白是IL-6, NF-κB, Lin28B, c-Myc 和 p-FOXO1。第三部分：Let-7b及miR-27a参与调控IL-6引发的HepG2细胞炎性恶变体外分子机制研究目的：探索miRNAs let-7b, miR-27a是否与炎症细胞因子IL-6,核转录NF-κB及抗凋亡蛋白p-FOXO1存在相互联系进而促进炎性恶变,明确上述分子所存在的馈路关系。方法：将let-7b拟似物及抑制剂转入人肝癌HepG2细胞,并外源性加入IL-6,观察细胞增殖克隆情况；采用蛋白免疫印迹检测Lin28B表达水平；采用免疫荧光法检测STAT3及p-FOXO1在胞浆中共定位情况。在外源性加入IL-6条件下,分别检测HepG2细胞转入let-7b及miR-27a拟似物或抑制剂后,分子通路P-STAT3, FOXO1, p-FOXO1, NF-κB (P50, P65)表达情况。结果：软琼脂糖增殖克隆实验结果显示let-7b拟似物可抑制克隆形成,相反,let-7b抑制剂则促进克隆形成,IL-6具有促进克隆形成作用。蛋白免疫印迹系统阐明了IL-6可激活p-STAT3,并促使NF-κB上调。一方面,在IL-6/NF-κB联合作用下Lin28B上调,抑制let-7b, let-7b下调进一步促进IL-6/NF-κB表达；另一方面,FOXO1受miR-27a调控。以上结果提示存在信号馈路IL-6/STAT3/NF-κB/ Lin28B/let-7及IL-6/NF-κB/miR-27a/FOXO 1与肝肿瘤祖细胞生成事件相关。结论：AA I致比格犬肝脏急性炎性恶变过程中,IL-6/STAT3/NF-κB/Lin28B/ let-7b馈路耦联IL-6/NF-KB/miR-27a/FOXO 1与肝肿瘤祖细胞生成事件相关。Let-7b及miR-27a与IL-6致人肝癌HepG2细胞急性炎症恶性转化事件呈相关性,可致p-STAT3, c-Myc, Lin28B, NF-κB (P50, P65)和FOXO1/p-FOXO1表达发生相应改变。