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目的：第一部分：通过对男性原发不育患者Y染色体微缺失的分析研究,探讨Y染色体微缺失的临床意义,为临床进行男性不育的诊断、治疗以及辅助生殖技术提供相应的理论依据。第二部分：回顾性分析Y染色体微缺失患者行ICSI-ET治疗的胚胎受精率、卵裂率、优胚率、妊娠率及早期流产率等指标,初步探讨Y染色体微缺失是否影响ICSI治疗结局。第三部分：通过多重置换扩增(MDA)联合聚合酶链式反应(PCR)建立单细胞AZF检测方法,为临床Y染色体微缺失患者植入前胚胎行AZF检测提供新的方法,为患者合理选择移植胚胎和更确切的遗传学咨询提供依据。方法：第一部分：以2012年1月～2012年10月于天津市中心妇产科医院生殖中心就诊的男性原发无精子症、严重少弱精子症和少精子症患者122例为研究对象。所有患者均按照世界卫生组织(WHO)推荐的方法和诊断标准加以确诊,排除内分泌失调及输精管阻塞等因素。留取上述患者外周血2mL,乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝,标本在检测前置-20℃冰箱保存。选取30例已正常生育的健康男性为对照。采用盐析法提取DNA,选取15个位点进行Y染色体微缺失检测,包括AZFa区的sY82、sY84、sY86,AZFb区的sY124、sY127、sY128、sY133、sY134、sY143,AZFc区的sY239、sY242、sY254、sY255,AZFd区的sY145、sY152。将这15个位点组成4套多重PCR系统,分别为系统Ⅰ：SRY、sY254、sY143、sY242、sY255,系统Ⅱ：SRY、sY84、sY239、sY152,系统Ⅲ：SRY、sY86、sY127、sY145、sY124,系统Ⅳ：SRY、sY134、sY82、sY128、sY133。每套系统中以SRY基因作为内对照,同时以空白和己正常生育的男性作外对照。第二部分：回顾性分析5例Y染色体微缺失患者的6个ICSI周期和同期治疗的无Y染色体微缺失的严重少弱精子症或无精子症患者的胚胎情况,共57例62个ICSI周期,所有患者精液分析均按WHO标准,连续2次精液分析并经离心沉淀均无精子者为无精子症,精子浓度<5×106/ml者为严重少精子症。所有患者均排除染色体核型异常且行Y染色体微缺失检测。观察分析两组间患者的受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎着床率、生化妊娠率、临床妊娠率和早期流产率。第三部分：选取天津市中心妇产科医院生殖中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的86例男性原发不育患者为研究对象,提取外周血DNA及单淋巴细胞,采用MDA方法对单／两个淋巴细胞进行全基因组扩增,扩增成功的单淋巴细胞行性别鉴定(采用DYZ1/DXZ1引物,引物序列如下：DYZ1:5’-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC-3’,5’-TTGAATGGAATGGGAACG AATGG-3’DXZ1:5’-AATGTGCAAGTGGCTATTTAGCG-3’5’-TCCATCATAAGG AATGTTCAGCT-3’),最后行AZF微缺失检测。比较外周血DNAAZF检测结果和单/两个淋巴细胞MDA扩增后的AZF检测结果,检验单细胞MDA-PCR-AZF检测方法的可行性和准确性。结果：第一部分：本研究收集男性不育患者122例,检出AZF基因微缺失患者共12例,总缺失率为9.8%(12/122),其中无精子症组、严重少弱精子症组和少精子症组患者的缺失率分别是11.1%(5/45)、10.9%(6/55)、4.5%(1/22)；对照组30例正常男性均未发现AZF基因微缺失。12例AZF微缺失患者中,9例AZFc缺失,8例AZFd缺失,3例AZFa缺失。AZF缺失类型有3种,其中AZFc+d缺失8例,AZFa缺失3例,AZFc缺失1例。无精子症组和严重少弱精子症组患者Y染色体微缺失率明显高于少精子症组,差异有统计学意义(p<0.05)。Y染色体微缺失对男性不育有重大影响,是造成男性不育的重要原因之一。第二部分：Y染色体微缺失组患者的受精率明显低于无Y染色体微缺失组(P<0.05),两组间患者的胚胎卵裂率、优质胚胎率、胚胎着床率、生化妊娠率、临床妊娠率和早期流产率的差异不明显(P>0.05)。提示Y染色体微缺失对ICSI治疗结局可能有一定影响,但需大样本研究进一步证实。第三部分：(1)MDA扩增结果：本研究中86例男性单淋巴细胞MDA扩增成功率为98.8%(85/86),30例女性淋巴细胞MDA扩增均成功,成功率为100%。(2)性别鉴定结果：MDA扩增成功的淋巴细胞行性别鉴定,性别均与其血来源相符,阴性对照和空白对照均未见阳性结果。可以认为性别鉴定引物选择合适,性别鉴定成功率为100%。(3)AZF检测结果：86例男性不育患者外周血DNA中共检出9例Y染色体微缺失,缺失率为10.5%(9/86),其中3例为AZFa(SY84)缺失,4例为AZFc+d缺失(SY254、SY255、SY242、SY239、SY125),1例为AZFb缺失(SY134)；1例为AZFc缺失(SY254、SY255)。85例单淋巴细胞MDA扩增成功患者AZF检测总成功率为97.6%(83/85),其中无缺失组76例男性患者单淋巴细胞AZF检测成功率为98.7%(75/76),一例出现AZFb(SY134)缺失,AZF检测结果符合率98.7%(74/75)；9例缺失患者中AZF检测成功率88.9%(8/9),AZF缺失类型与外周血完全一致,符合率100%,其中2例AZFa(SY84)缺失,4例AZFc+d缺失(SY254、SY255、SY242、SY239、SY125),1例AZFb缺失(SY134),1例AZFc缺失(SY254、SY255)。结论：1.进一步确定Y染色体微缺失是引起男性不育的一个重要原因,临床治疗中,该类患者应常规行Y染色体微缺失检测,并为患者提供遗传咨询,同时为是否需要行植入前遗传学诊断提供临床依据。2.Y染色体微缺失可能对ICSI-ET治疗结局有一定影响,可造成受精率降低,但卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、早期流产率等差异不明显,故Y染色体微缺失对ICSI治疗的影响还需更大样本量的研究证实。3.本实验成功建立了MDA-PCR-AZF方法对单细胞进行Y染色体微缺失检测,同时进一步完善了单细胞多重置换扩增方法,提高扩增单个细胞的成功率。为临床ICSI治疗Y染色体微缺失患者提供新的方法,具有重要的临床应用价值。