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恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）是革兰氏阴性菌,能用于环境污染治理和特殊工业材料的生产。但其生理代谢机制的研究较为有限。本课题采用生物化学、遗传学和分子生物学等技术手段,对恶臭假单胞菌脂肪酸代谢相关基因的功能展开了研究,取得了如下成果:恶臭假单胞菌F1中有两个位于同一基因簇的脂酰CoA合成酶的编码基因:Pput＿1340（PpfadD1）和Pput＿1339（PpfadD2）,本课题第二部分对PpfadD1和PpfadD2进行了鉴定与功能研究。（1）遗传互补大肠杆菌脂酰CoA合成酶突变株JW1794-1,发现PpfadD1和PpfadD2能够恢复其在以油酸为唯一碳源的基础培养基上的生长。同时利用定点突变技术,改变Pp Fad D1和Pp Fad D2的ATP/AMP结构域中相关氨基酸残基,结果证明这两个酶都具有大肠杆菌Fad D类似的结构特征。这些结果表明Pp Fad D1和Pp Fad D2都具有脂酰CoA合成酶的活性。（2）采用同源重组技术构建了恶臭假单胞菌F1的PpfadD1、PpfadD2单突变和双突变菌株。在以不同链长脂肪酸为唯一碳源的基础培养基上检测这些突变菌株的生长,结果显示PpfadD1的单突变在各种链长脂肪酸中的生长明显滞后,而PpfadD1和PpfadD2双突变株的这种表型更加明显,表明Pp Fad D1是主要负责外源脂肪酸活化利用的酶,Pp Fad D2起辅助作用。同时以恶臭假单胞菌不饱和脂肪酸合成突变菌株des AfabA突变株为出发菌株,利用同源重组分别获得了PpfadD1和PpfadD2三突变株,生长表型分析显示油酸难以恢复des AfabAfad D1三突变的生长。这再次说明Pp Fad D1是恶臭假单胞菌对外源脂肪利用的关键酶。（3）利用14C乙酸钠喂养PpfadDs突变株,分析培养液中的脂肪酸组成,发现PpfadD1单突变和PpfadD1PpfadD2双突变株的胞外有较多的脂肪酸积累,而双突变菌株积累的脂肪酸明显高于单突变株。另外,研究显示枯草芽孢杆菌脱饱和酶基因des A不能恢复des AfabAfad D1三突变突变株的不饱和脂肪酸合成。这些均表明Pp Fad D1也是恶臭假单胞菌对内源脂肪酸利用的关键酶。（4）PpfadD1的突变还影响恶臭假单胞菌的运动性。在恶臭假单胞菌F1中与大肠杆菌3-酮脂酰ACP合成酶I（Fab B）同源的基因有一个:Pput＿1693（PpfabB）,而与大肠杆菌3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ（FabF）同源的编码基因有两个:Pput＿3798（PpfabF1）与Pput＿2422（PpfabF2）。本文第三部分对这三个同源基因进行了功能研究,得出了以下结果:（1）遗传互补大肠杆菌fabB与fabF的突变株,结果发现:PpfabB能够恢复大肠杆菌fabB突变株不饱和脂肪酸的合成,表明PpfabB具有3-酮脂酰ACP合成酶I的活性;PpfabF1能够恢复大肠杆菌fabF突变株的顺-十八烯酸合成,说明具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ的活性。而PpfabF2不仅能够恢复大肠杆菌fabB突变株不饱和脂肪酸的合成,而且也能弥补大肠杆菌fabF突变株顺-十八烯酸的合成,表明Pp Fab F2既具有3-酮脂酰ACP合成酶I活性,又具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ的活性。（2）采用Ni-NTA亲和层析的方法,纯化获得Pp Fab B、Pp Fab F1和Pp Fab F2蛋白。体外重建的脂肪酸合成反应表明:Pp Fab B能够延伸不饱和脂肪酸合成,具有3-酮脂酰ACP合成酶I的活性;Pp Fab F1能延伸饱和脂肪酸合成,具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ的活性。而Pp Fab F2能够延伸饱和与不饱和脂肪酸的合成,具有3-酮脂酰ACP合成酶I和Ⅱ的双重活性。（3）利用同源重组构建了PpfabF1、PpfabF2单突变和双突变株以及PpfabB的单突变株。生长表型测定显示PpfabB的突变株是不饱和脂肪酸营养缺陷型,表明PpfabB负责恶臭假单胞菌不饱和脂肪酸合成。测定PpfabFs突变株脂肪酸的组成,发现PpfabF1突变株顺-十八烯酸含量显著的下降,说明PpfabF1负责饱和脂肪酸合成。另外研究发现过表达PpfabF2能够弥补PpfabF1和PpfabB的功能缺失。但是在相同的表达水平下,PpfabF2的互补菌株的脂肪酸含量低于PpfabF1和PpfabB自身的互补,表明Pp Fab F2对脂肪酸的延伸活性低于Pp Fab F1和Pp Fab B。（4）采用基因融合和DNA 5’race技术分析PpfabB的转录表达,结果显示在恶臭假单胞菌中不仅PpfabB与PpfabA能够共转录,而且PpfabB还有自己的启动子,能够独立转录。