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膜联蛋白5(annexin5)是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白,其分子量约为36kD,annexin5因为其基因5’区域不含有TATA阅读框,而被认为是一管家基因。其具有多种生物学功能,如抗凝血、抑制蛋白酶C的活性等。本课题组先前的研究发现,annexin5对睾酮合成的调控作用呈明显的时间和剂量依赖性。StarD7是类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运结构域蛋白家族成员之一,该蛋白在脂质转运、细胞代谢、相关信号转导等方面发挥着重要的生物学功能。其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运体结构域(START),该结构域由210个氨基酸残基组成,可特异性的结合脂类,如磷脂类、甾醇类、鞘脂类等。其主要参与脂质转运的过程,它能与膜上的靶蛋白结合,并发挥着催化剂的作用。本课题组先前的研究利用二维凝胶电泳技术建立了annexin5刺激大鼠睾丸Leydig细胞睾酮分泌的差异蛋白谱,发现在annexin5刺激的Leydig细胞中上调蛋白有23个,下调蛋白有13个,其中StarD7是典型的上调蛋白。相关文献报道Wnt/β-catenin信号通路参与StarD7蛋白的起始调控。StarD7和Wnt/β-catenin信号通路是否参与调节annexin5刺激大鼠睾丸间质细胞睾酮合成,为回答这个问题,本实验从以下三部分展开：第一部分,观察StarD7、β-catenin参与调控annexin5刺激大鼠睾丸间质细胞睾酮合成的过程,结果发现,在annexin5刺激作用下,伴随着睾酮合成的增加,StarD7、β-catenin在蛋白表达水平均有所增加,并且免疫荧光的结果显示,β-catenin在胞质内有聚集并进入核内的趋势。第二部分,利用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Dkkl与A5共同作用于原代睾丸Leydig细胞,观察Wnt/β-catenin信号通路被抑制后,大鼠睾丸Leydig细胞睾酮合成是否有变化。初步结果发现,在Dkk1的单独作用下,睾酮、StarD7、 β-catenin、3β-HSD、17β-HSD的表达均有所下降,且在Dkkl和A5共同作用下,与单独A5作用相比,睾酮、StarD7、β-catenin、3β-HSD的表达均有不同程度的下降。由此提示Wnt/β-catenin信号通路参与Leydig细胞睾酮合成,并可能是通过StarD7、3β-HSD来具体调控睾酮合成的过程。第三部分,利用siRNA干扰技术干扰StarD7蛋白的表达,观察StarD7被干扰后大鼠睾丸Leydig细胞睾酮合成是否有影响。为提高siRNA干扰效率,我们进行了一系列的条件优化,发现在细胞密度为80%、siRNA-StarD7干扰浓度为100nmol/L、siRNA-StarD7与GenEscortTM Ⅱ转染试剂的比例为1：2的条件下,干扰效果较好。在此基础上,在StarD7的表达被干扰后,睾酮合成明显下降,其关键合成调节酶3p-HSD、17β-HSD在mRNA水平和蛋白水平均有显著性下降。由此说明,睾酮的合成可能是通过StarD7的表达从而间接调节睾酮合成关键调节酶来调控的。由此我们得出结论,Wnt/β-catenin信号通路和StarD7均参与annexin5刺激睾酮的合成,并且其具体的调控机制可能是通过annexin5的刺激作用下,激活Wnt/β-catenin信号通路,促使StarD7的表达增加,从而导致睾酮合成的关键调节酶的表达增加,最终导致睾酮合成的增加。