背景镉(Cadmium, Cd)是一种高度毒性的重金属,主要来源于冶炼、石油燃烧、工业废物、金属澄清剂以及香烟等。除职业工人外,普通居民因污染的水、空气和土壤而日益成为潜在的接触人群。Cd能引起癌症、肾和生殖功能障碍,以及神经功能紊乱。Cd暴露可引起儿童的学习障碍。成人Cd作业者可表现出神经性缺陷如心理反应速度减慢；同时工人主诉平衡能力下降和注意力减退。Cd诱导的神经毒性包括细胞死亡、神经生物化学改变(神经递质和受体)和生理/行为的改变。Cd可造成两种形式的细胞死亡：caspase依赖的凋亡和caspase不依赖的坏死样死亡。文献报道,Cd能诱导神经细胞同时发生凋亡及坏死样死亡。Cd通过复杂的信号通路诱导神经细胞死亡,包括：氧化应激,MAPKs (Mitogen-activated protein kinases)和mTOR的激活。然而在Cd诱导的神经细胞死亡中,凋亡及坏死样死亡的作用仍不清楚。此外,Cd诱导的坏死样死亡的分子机制仍然未知。BNIP3蛋白(Bcl-2and adenovirus E1B-19kDa-interacting protein3),是Bcl-2蛋白家族中BH3-only亚家族的一员,在细胞死亡中发挥重要作用。BNIP3广泛涉及多个病理过程,例如心肌肥大和萎缩、肿瘤形成和神经系统缺氧/缺血。最新的研究发现BNIP3与神经退行性疾病亨廷顿氏病(Huntington’sDisease, HD)密切相关,在HD病人的肌肉细胞及HD动物模型的脑组织中均检出BNIP3的异常积聚。当前,越来越多的研究结果表明BNIP3参与caspase不依赖的细胞死亡。此外,有研究显示某些毒素如氰化物和钴(Cobalt, Co)(?)诱导细胞表达BNIP3,且BNIP3参与这些毒素诱导的细胞死亡。然而,Cd诱导的神经毒性中BNIP3是否发挥同样的作用未见报道。MAPKs是Cd诱导神经毒性中的重要分子。MAPKs由丝氨酸-苏氨酸激酶级联放大信号组成。哺乳类动物的MAPKs家族包括细胞外信号调节激酶(ERK), p38和c-Jun NH2端激酶(JNK)。很多研究表明MAPKs参与神经炎症反应和神经变性过程。尽管MAPKs对Cd诱导的神经毒性有着重要作用,但其下游分子仍然未知。目的本研究通过联合使用多种细胞生物学和分子生物学实验方法,如RNA干扰、qRT-PCR、蛋白免疫印迹、台盼蓝排斥法和PI染色等,探讨BNIP3在Cd诱导神经毒性中的作用和分子机制。方法1.我们选择SH-SY5Y和PC12细胞为研究对象。采用台盼蓝排斥法检测不同Cd浓度条件下神经细胞的死亡率。2.Cd处理细胞不同时间点后使用免疫印迹法检测caspase-3和PARP蛋白的表达。预先使用pan-caspase抑制剂(zVAD-fmk)或两个坏死抑制剂(Necrox-2和Necrox-5)处理神经细胞,然后加入Cd处理神经细胞12h。通过台盼蓝染色及检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量,计算各组死亡率。3.分别使用qRT-PCR和免疫印迹,检测Cd处理的神经细胞BNIP3基因和蛋白的表达。4.通过瞬时转染化学合成的siRNA,下调BNIP3表达。RNAi下调BNIP3表达后,Cd处理神经细胞24h。通过台盼蓝排斥法检测Cd诱导的细胞死亡率；通过共聚焦显微镜检测并计算PI阳性细胞数；检测培养基中LDH含量。5.分别使用Cd或Co处理神经细胞,通过免疫印迹检测HIF-1α蛋白的表达,通过qRT-PCR检测血管内皮生成因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)基因的表达。6.使用免疫印迹检测Cd处理细胞不同时间的MAPKs激活情况。7.预先使用MEK (ERK的上游激酶)抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125或p38抑制剂SB203580处理细胞30分钟,然后加入Cd处理神经细胞24h。使用免疫印迹检测BNIP3蛋白的表达及caspase-3的活化,通过台盼蓝排斥法检测细胞死亡率。8.构建小鼠Cd染毒模型。将20只雄性BALB/c鼠随机分成对照组及Cd处理组(10只/组)。Cd处理组小鼠每天接受腹腔注射氯化镉溶液(生理盐水溶解,lmg/Kg体重),对照组注射等量的生理盐水,连续注射2周。收集小鼠脑组织,使用Quadrupole ICP-MS仪器检测Cd浓度,同时使用免疫印迹检测BNIP3蛋白的表达及MAPKs的激活。9.实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示,数据经SPSS13.0软件处理。两组均数比较用Independent-samples t Test。多组样本均数比较,使用One-way ANOVA方差分析。如果方差齐多重比较采用LSD方法检验,若方差不齐多重比较采用Dunnett’s T3, P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1.台盼蓝排斥法结果显示Cd处理细胞24h后,两个细胞均有不同程度的死亡发生,且呈现浓度依赖性,死亡率随着浓度的升高而增加。2.Cd诱导神经细胞caspase-3和PARP蛋白的活化。100μM zVAD-fmk预处理可明显降低cleaved caspase-3的表达,却仅能轻微抑制Cd诱导的神经细胞死亡。0.3μM Necrox-2或0.1μM Necrox-5(两种坏死抑制剂)处理细胞并不影响cleaved caspase-3的表达,但能显著减少Cd诱导的细胞死亡,且其抑制作用较zVAD-fmk组更为明显(p<0.01)。同时,Necrox-2或Necrox-5可抑制Cd暴露的神经细胞LDH的释放,且Necrox-2/5的抑制作用显著大于zVAD-fmk组(p<0.05)。3.Cd浓度及时间依赖地诱导BNIP3基因的表达。其中20μM的Cd处理细胞12h即出现BNIP3基因的表达上升,并持续升高至48h。与BNIP3基因表达相似,Cd强烈诱导BNIP3蛋白的表达,且呈现浓度及时间依赖性。此外,Co增加了BNIP3蛋白表达,其蛋白的条带模式与Cd处理相似。4.与转染空白siRNA组比较,转染siRNA-1、2及3对Cd诱导BNIP3表达抑制作用小,而转染siRNA-4显著降低Cd诱导的BNIP3蛋白表达(抑制率约为95%)。此外,siRNA-4能浓度依赖地抑制Cd诱导的BNIP3表达。重要的是,转染siRNA-4亦能浓度依赖地降低Cd诱导的神经细胞死亡,分别降低35.04%、49.03%及61.34%。5.与细胞死亡数据相似,干扰BNIP3表达可降低Cd诱导的PI阳性细胞数及细胞培养基中LDH的释放量。然而干扰BNIP3表达并不改变Cd诱导的cleaved caspase-3的表达。6.作为阳性对照的Co能诱导SH-SY5Y细胞表达HIF-1α蛋白,并呈现时间依赖性。然而,Cd在任意时间都无法诱导HIF-1α蛋白表达。VEGF是HIF-1α公认的下游靶基因。Co处理神经细胞能显著上调VEGF的基因表达,然而Cd处理细胞却未能达到同样的效果。7.Cd激活MAPKs。Cd处理的神经细胞磷酸化ERK、p38和JNK增加,且各激酶的激活呈现不同的时间效应。ERK在1h达到峰值,随后8h逐渐恢复至基础水平。P38随时间逐渐增强,并持续上升至8h。磷酸化的JNK到4h才出现激活,且4h即达到峰值水平。8.ERK抑制剂U0126能明显抑制Cd诱导的BNIP3上调及细胞死亡。JNK抑制剂SP600125显示出相似的效果。然而P38抑制剂SB203580对Cd诱导的BNIP3表达无影响,却升高了Cd诱导的细胞死亡。同时,ERK抑制剂U0126能明显抑制Cd诱导的cleaved caspase-3表达。JNK抑制剂SP600125对cleaved caspase-3表达影响不明显。相反,P38抑制剂SB203580能增强Cd诱导神经细胞的cleaved caspase-3表达。9.Cd暴露组的小鼠脑组织Cd浓度显著高于对照组。更为重要的是,Cd暴露可诱导小鼠的皮层及海马组织表达BNIP3蛋白。这些组织的MAPKs亦被激活。结论1.Cd诱导神经细胞发生凋亡和坏死样死亡,其中坏死样死亡是主要的死亡方式。2.本文首次报道了Cd强烈诱导离体神经细胞及活体脑组织BNIP3基因及蛋白表达。3. BNIP3介导Cd诱导的坏死样死亡,而非凋亡。4.Cd诱导神经细胞死亡中,BNIP3的表达与HIF-1通路无关。5.Cd在离体及活体水平诱导MAPKs的激活。其中ERK和JNK通过调控BNIP3表达参与Cd诱导的细胞死亡。P38通过抑制caspase-3表达而促进细胞存活,且与BNIP3的表达无关。综上所述,本研究证明BNIP3介导Cd诱导的神经细胞坏死样死亡。ERK和JNK是其重要的上游调控分子。结合动物实验数据,本文结果为进一步的神经毒性机制研究及发展新的防治方法奠定基础。