一株抗水稻稻瘟病芽孢杆菌的分离及其活性成分分析

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水稻稻瘟病是由稻瘟病真菌引起的水稻病害,具有分布广、破环力强的特点。它是影响水稻产量的三大病害之一,目前主要以喷洒化学农药的手段来防治。但是长期的使用化学农药会造成环境污染问题,以及人类健康问题。近年来,应用生物防治来解决植物病害得到越来越多的关注。本论文从中药材白芷中筛选出对水稻稻瘟病有较强拮抗作用的细菌,然后进行了后续研究,主要的实验及结果如下:1.菌种分离鉴定:在平板对峙试验中分离得到13株对水稻稻瘟病有抑制活性的菌株,我们选取活性最强的一株做为后续研究,使用光学显微镜及扫描电子显微镜对拮抗菌进行了形态的观察,以及革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色及芽孢染色,然后测定了拮抗菌的生理生化指标,16S rDNA基因序列分析发现GYLH-1与特基拉芽孢杆菌Bacillus Tequilensis KCTC 13622(AYTO01000043)的相似性达到99.93%,确定其属于特基拉芽孢杆菌,命名为特基拉芽孢杆菌GYLH-1。抗生素药敏检测GYLH-1对四环素等14种抗生素比较敏感,只对新霉素、青霉素2种抗生素具有耐药性。2.发酵条件优化:确定菌株GYLH-1发酵培养基为Landy培养基,发酵时间为48h,初始pH为7,发酵温度为28℃。提高了活性物质的产率,为下一步的研究奠定了基础。3.拮抗相关物质检测及模拟大田实验:GYLH-1能够产生对真菌有拮抗作用的蛋白酶,纤维素酶,明胶酶和过氧化氢酶。GYLH-1还能产生与促进生长相关的ACC脱氨酶,IAA和铁载体。PCR检测GYLH-1基因组内存在与非核糖体多肽类物质及聚酮类化合物合成相关的PKS II和NRPS基因。水稻叶片离体实验及大田模拟实验结果表明GYLH-1对稻瘟病有显著的防治效果。4.活性物质的稳定性分析及分离纯化:GYLH-1产生的活性物质对高温和蛋白酶K都有很好的耐受性,同时具有很好的光稳定性。活性物质在中性条件下抑菌活性最强,酸性条件下均有活性但随着酸性增强抑菌活性有所降低,在碱性条件下活性基本丧失。我们使用MCI柱色谱与硅胶柱色谱对活性物质进行初步的分离,再使用高效液相色谱进行更进一步的分离纯化,最后得到单一物质进行质谱检测,检测结果显示该物质的分子量为292.8。我们将分子量在数据库中比对分析后,推断该单一物质是一种未知的抗生素。
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