白蜡合成关键酶FAR3基因克隆、表达与初步生化特性分析

来源 :中国林业科学研究院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yedayong0007
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白蜡主要是由定杆期的白蜡虫Ericerus pela二龄雄虫分泌,是一种天然超长链单酯,被广泛应用在食品、化工、医药以及化妆品或精密仪器等领域。蜡酯的生物合成途径在动植物中保守,主要由脂酰辅酶A还原酶(fatty acyl-Co A reductase,FAR)与蜡酯合酶(wax synthase,WS)催化生成。由于生物体中存在多个FAR,其生理功能各不相同,需对FAR的蛋白表达、生化特性等进行研究,才能明确该酶参与蜡酯合成的机理。本研究通过三代全长转录组测序筛选获得与白蜡合成相关的far基因,针对其中的一个far基因进行了c DNA克隆和序列分析、原核表达、抗体制备、在雌雄虫中蛋白表达分析以及生化特征分析等研究,结果表明,获得的该FAR3蛋白在白蜡虫二龄雄虫中表达量非常高,远高于雌虫,初步的生化特性分析表明,该酶的最适温度与白蜡生产中的环境温度比较一致,最适底物与白蜡的主要成分一致。主要研究结果如下:(1)对白蜡虫泌蜡初期的二龄雄虫成功进行了转录组测序,共获得81个far基因,筛选获得与白蜡虫泌蜡一致的6个基因,其中本研究关注的一基因命名为far3。(2)成功获得了far3 c DNA全长以及ORF;经序列分析,FAR3具有FAR_C超级家族的保守结构;系统发育分析,FAR3与人类、小鼠和果蝇等参与蜡酯合成的FAR聚为一支,初步说明白蜡虫FAR3可能在白蜡合成中起作用。(3)FAR3原核表达载体p ET-30a-e GFP/Epel FAR3成功构建,诱导表达获得大量FAR3目的蛋白,对该蛋白进行体外酶活分析,发现通过此途径表达的FAR3蛋白不具有生物活性。(4)利用原核诱导表达的FAR3蛋白成功制备了FAR3的单克隆抗体,通过单克隆抗体分析了FAR3在白蜡虫雌雄虫中的表达情况,证实FAR3在二龄雄虫中大量表达,在雌虫中有微量表达。(5)构建FAR3真核表达载体p IZ/V5-FAR3-Linker-e GFP转入Bm N家蚕细胞并成功表达,筛选获得稳定表达FAR3的细胞系。(6)利用家蚕细胞表达获得FAR3蛋白,通过体外酶活反应进行了FAR3生化特征的初步探究,确定了家蚕细胞表达的FAR3蛋白具有生物活性,明确FAR3可催化C28脂酰辅酶A还原为C28脂肪醇,体外酶活反应的最佳p H值为3.0,最适反应温度为35℃,与泌蜡特点一致。本研究初步确定了FAR3是参与白蜡合成的,为白蜡虫其他FAR的研究提供了参考,对于白蜡虫分泌白蜡生化机理的研究具有重要意义。
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