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早在上世纪初,丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)就被用于生产丙酮和丁醇,但是二战后石油化工业的迅猛发展使这种丙酮丁醇发酵工业渐渐淡出人们的视线。近年来,随着石油资源的日益减少,发展可再生能源已经变得日益紧迫,因此发酵法生产丁醇又具有了非常重要的意义。
代谢流量分析是代谢工程研究的重要工具,本论文的目的是通过对丙酮丁醇梭菌的代谢流量分析,绘制出丙酮丁醇梭菌的代谢流量图,从而找到限制梭菌细胞代谢网络中丙酮、丁醇产量的代谢节点,为采用生物工程技术提高丁醇产量提供理论依据。
全文包括以下几个方面:
第一章:详细介绍了代谢流量分析的概念、代谢流量分析原理以及目前常用的几种代谢流量分析的方法,并对近年来代谢流量分析的进展进行了评述。
第二章:为了建立丙酮丁醇梭菌稳态时的代谢流量分析模型,发展了一种采用间接紫外检测的毛细管电泳方法用于丙酮丁醇梭菌代谢产物中有机酸的测定。该法简单可靠,样品预处理简便,且分析速度快。该方法已经成功用于两种丙酮丁醇梭菌代谢产物中有机酸的测定并应用于其他各类样品中的有机阴离子分析。
第三章:基于胞外代谢物的流量分析。应用稳态代谢平衡,建立了丙酮丁醇梭菌代谢流量分析的数学模型,并对该模型的准确性进行了验证。随后利用所建立模型成功地对丙酮丁醇梭菌ATCC824和EA2018进行了代谢流量分析,并对两者进行了比较。所得结果表明丙酮丁醇梭菌代谢过程中,乙酰乙酰辅酶A的代谢是影响丁醇产量的主要节点,通过对其相关基因的改造,已取得阶段性进展。
第四章:基于胞内代谢物的流量分析。为了进一步验证所建立的丙酮丁醇梭菌代谢流量分析数学模型的准确性,我们尝试对丙酮丁醇梭菌主代谢途径中的胞内代谢中间产物,三种辅酶A衍生物进行测定。我们通过优化成功地实现了对三种辅酶A衍生物标准品的毛细管电泳的在线富集和分离检测,之后又比较了四种丙酮丁醇梭菌胞内代谢产物提取方式。最后对最优化提取方式下的实际样品进行了测定,但是在仅用紫外检测的条件下,实际样品的分析并不理想,因而限制了其应用。
第五章:描述了一种简单快捷的通过柱上衍生结合毛细管胶束电动色谱分离方法用于测定不同结构手性胺类化合物的ee值。通过自动化衍生将对映体转化为非对映异构体使得伯胺类的手性分离变得简单,而且特别适合缺乏生色基团的手性胺的手性分离测定。衍生和分离过程通过仪器能自动进行,缩短了分析所用时间,增加了分析通量。通过对衍生条件以及分离条件的优化,实验中所选的五种手性胺都在同一条件下成功衍生并达到基线分离。本章所描述的方法还可用于不对称催化剂的筛选和评估。