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目的微小RNA 21(miR-21)与DNA甲基化在乳腺癌发生过程中均发挥重要作用,与癌细胞增殖密切相关。然而二者在乳腺癌中的相互调节关系则知之甚少。因此本研究首先以探究乳腺癌细胞中miR-21与DNA甲基化的相互调节作用为切入点,进一步通过调节miR-21的表达及DNA甲基化水平研究二者在乳腺癌增殖中的联合作用。方法以LV3为载体,病毒包装miR-21抑制剂及其阴性对照序列感染MCF-7、MDA-MB-231细胞,使用荧光显微镜观察其转染效率及Real-time PCR检测miR-21表达的抑制率,接以bisulfite-qMSP检测基因组DNA甲基化水平,并以Real-time PCR及Western blot分别对DNA甲基化转移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的RNA和蛋白表达水平以及RAS通路中的重要分子H-RAS、RASGRP1进行检测。反之,以2.5μM DNA甲基化酶抑制剂5-Aza处理细胞72小时,观察DNA甲基化改变对miR-21表达水平的影响。以BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)法检测miR-21抑制剂与5-Aza在乳腺癌细胞增殖中的联合作用,并以流式细胞仪对细胞周期及细胞凋亡进行检测。结果荧光显微镜观察结果显示,LV3-AS-miR-21及LV3-NC均能有效感染细胞,LV3-AS-miR-21可显著敲低细胞内miR-21的表达水平(P<0.05)。同时发现,敲低miR-21表达,可显著降低MCF-7(P<0.05)细胞整体DNA甲基化水平,并引起转录水平上Dnmt1、Dnmt3a(P<0.05)的升高及Dnmt3b的降低(P<0.05)。而在MDA-MB-231细胞内则发现其整体DNA甲基化水平有所升高(P<0.05),同时伴随有Dnmt1(P<0.05)、Dnmt3a(P<0.05)及Dnmt3b(P<0.05)在RNA水平的表达升高。同时在对Dnmts蛋白水平的检测中发现,miR-21的低表达可引起MCF-7细胞内Dnmt3b蛋白水平的明显降低。相反的,其在MDA-MB-231细胞内的表达则显著升高。我们同时发现,敲低miR-21的表达,可明显降低MCF-7细胞内RASGRP1(P<0.01)的表达水平,而在MDA-MB-231细胞中则可显著上调H-RAS(P<0.01)及RASGRP1(P<0.05)的表达水平。使用5-Aza处理细胞则发现,其在显著降低两种细胞基因组DNA甲基化水平(P<0.01)的同时,可有效上调miR-21的表达水平(P<0.01)。BrdU检测结果发现,甲基化酶抑制剂5-Aza可协同miR-21抑制剂进一步抑制MCF-7细胞的增殖(P<0.01);而在MDA-MB-231细胞中发现,5-Aza的使用亦可进一步增强miR-21抑制剂对细胞增殖的抑制作用(P<0.01)。进一步的细胞周期及凋亡检测发现,相对于单独处理,5-Aza与miR-21抑制剂联合使用可进一步加剧MCF-7细胞G1/S期阻滞并进一步降低周期调控蛋白Cyclin D1的蛋白表达水平。结论病毒介导的miR-21抑制剂对乳腺癌MCF-7与MDA-MB-231细胞DNA甲基化水平的调节截然相反,其中Dnmt3b发挥主要作用。这一过程可能有RAS信号通路的参与。而DNA甲基化的降低则可使两种细胞内miR-21的表达一致上调。与各自单独作用相比,DNA去甲基化可促进miR-21对乳腺癌细胞增殖的抑制作用,此抑制作用主要通过细胞周期调控蛋白Cyclin D1的表达改变所引起细胞周期发生改变而得以实现。本研究有助于深入了解乳腺癌的发生机制,并为日后临床上制定合理的乳腺癌治疗方案提供一定的实验依据。