论文部分内容阅读
旋毛虫病是一种严重的食源性人兽共患寄生虫病,其病原体为旋毛形线虫[Trichinella spiralis（Owen,1835）Railliet,1895],主要因生食或半生食含有旋毛虫幼虫的猪肉及其他动物肉类而感染,临床上在急性期有持续性高热、眼睑和面部水肿、全身性肌肉酸痛、过敏性皮疹、血中嗜酸性粒细胞增多等变态反应性表现,重症患者可因并发症而死亡。国际旋毛虫病委员会（International Commission on Trichinellosis,ICT）在1995-1997年间报道1万多例病人,现已被列入再度肆虐的疾病（re-emerging disease）。目前,由于旋毛虫不能在体外传代培养,阻碍了其侵入宿主分子机制、感染宿主后肠道排虫反应分子机制、抗旋毛虫药物筛选及旋毛虫疫苗研制等的研究,因此,旋毛虫肌幼虫体外培养的研究就显得尤其重要。本研究将旋毛虫肌幼虫在不同液体培养基中进行培养,观察幼虫蜕皮时间及培养不同时间后蜕皮幼虫的比例,并对未蜕皮肌幼虫长度进行测量:观察液体培养基（完全培养基+T84细胞）、半固体培养基（完全培养基+琼脂糖、完全培养基+琼脂糖+T84细胞）对幼虫蜕皮的影响;在半固体培养基（完全培养基+琼脂糖+Caco-2细胞）中观察幼虫经不同活化物处理后对其蜕皮的影响,并比较2种肠上皮细胞对幼虫蜕皮的影响。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物与细胞系本研究中所用的旋毛虫为旋毛虫河南株（Trichinella spiralis,T1）,昆明小鼠传代保种,人工消化法和贝氏法收集纯净的旋毛虫肌幼虫;实验动物为健康雄性6 w龄昆明小鼠和Sprague Dawley（SD）大鼠;所用细胞为人结肠癌细胞系（human colonic carcinoma cell line）T84和Caco-2细胞。2.大鼠肠内容物与小鼠胆汁的制备①将禁食8 h的大鼠剖杀后,将小肠用5 ml含抗生素的生理盐水冲洗,1 200 g离心10 min除去大的碎片,上清液即为肠内容物,用生理盐水1:2稀释后-20℃备用,用前再用生理盐水1:10稀释;②将禁食8 h的惺笃噬焙?取出完整胆囊,收集胆汁后-20℃备用,用前用生理盐水1:20稀释。3.旋毛虫肌幼虫在培养液中培养①将新鲜肌幼虫分别在生理盐水、PBS、RPMI-1640培养液和含5%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）RPMI-1640培养液等4种液体培养基中进行培养;②从培养第12 h开始,每隔2 h在倒置显微镜下观察并记录各组培养液中肌幼虫开始蜕皮的时间;③每24 h从培养箱取出培养瓶,混匀后吸取肌幼虫镜下观察并计数蜕皮的幼虫并拍照;选取约15条两端均未见明显蜕皮的幼虫拍照后测量长度。4.旋毛虫肌幼虫在3种不同培养基中的培养将新鲜的肌幼虫在大鼠肠内容物中孵育后分别在完全培养基（含10%FBS DMEM/F12培养基）+T84细胞、半固体培养基（完全培养基+1.75%琼脂糖）、半固体培养基+T84细胞中培养24 h,镜下观察并计数1期（未蜕下完整表皮的幼虫）及2～4期（蜕下完整表皮的幼虫）的幼虫。5.不同活化物对培养幼虫蜕皮的影响将新鲜的肌幼虫分别在生理盐水、RPMI-1640培养液、大鼠肠内容物或小鼠胆汁孵育后,悬浮至半固体培养基（含10%FBSDMEM培养基+1.75%琼脂糖）,并覆盖至Caco-2细胞层进行培养,24 h后镜下观察并计数1期及2～4期的幼虫。6.肠上皮细胞对培养幼虫蜕皮的影响在半固体培养基中观察T84和Caco-2细胞对培养幼虫蜕皮的影响。结果1旋毛虫肌幼虫开始蜕皮时间的观察在37℃5%CO2条件下,肌幼虫在RPMI-1640培养液、PBS、含5%FBS RPMI-1640培养液及生理盐水中开始蜕皮的时间分别为15 h、19 h、23 h及37 h,蜕皮多数从幼虫尾端开始。2旋毛虫肌幼虫活动性和蜕皮情况的观察旋毛虫肌幼虫接种至培养液时非常活跃,做伸展和卷曲运动,在生理盐水和PBS中培养3 d活动性即明显下降,5 d后基本不活动,在含5%FBS RPMI-1640培养液中培养至21 d时部分虫体仍有活动;幼虫在生理盐水和PBS中仅蜕皮1层,在RPMI-1640培养液中可蜕皮1～4层,在所观察的5 378条肌幼虫中,蜕皮1～4层的幼虫数分别是3 386条（62.96%）、1 377条（25.60%）、71条（1.32%）及14条（0.26%）;幼虫在含5%FBS RPMI-1640培养液中可蜕皮1～2层,分别占观察幼虫数的66.78%（3699/5539）及0.45%（25/5539）。3.未蜕皮肌幼虫长度变化的观察在RPMI-1640培养液中培养1～21 d的未蜕皮