木质纤维素来源的生物燃料是一种清洁的可再生能源,能部分替代目前人们对化石能源的需求,然而就目前的技术水平而言,将植物生物质高效转化为可发酵的单糖是生物燃料生产的主要瓶颈。自然界中存在大量能够降解植物生物质的微生物,是我们转化和利用木质纤维素的基础。其中丝状真菌瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是纤维素降解微生物的典型代表,它的一个重要生理特性是在不溶性的纤维素、半纤维素以及一些植物生物质组分存在条件下,能够大量分泌纤维素酶,从而有效水解植物生物质。因为这些不溶性的底物无法进入细胞,由它们释放的可溶性寡糖包括纤维二糖以及槐糖等被认为是真正的诱导物,但目前这种假设还缺少足够的实验证据。除了纤维二糖和槐糖,非植物细胞壁组分的乳糖也可以诱导瑞氏木霉产生纤维素酶,但目前人们对乳糖诱导纤维素酶表达的机制也不甚了解。虽然有实验证据表明乳糖的胞外水解以及随后的半乳糖代谢与纤维素酶诱导表达有一定相关性,但是也有证据表明瑞氏木霉对乳糖的吸收和胞内代谢在纤维素酶的诱导表达过程中起到重要作用。到目前为止在瑞氏木霉中负责胞内水解和转化乳糖的蛋白尚未得到鉴定。有证据显示瑞氏木霉p-葡萄糖苷酶在诱导物合成以及菌体快速响应纤维素的过程中发挥重要作用,例如胞外主要p-葡萄糖苷酶bgl1/cel3a基因的缺失导致纤维素酶基因诱导表达延迟,而过表达bgl1/cel3a基因的菌株在纤维素和槐糖诱导条件下纤维素酶基因的表达水平提高。基因组信息分析表明,瑞氏木霉一共含有11个p-葡萄糖苷酶编码基因,其中Bgl1/Cel3a是胞外主要的p-葡萄糖苷酶,属于糖苷水解酶第3家族,而Cel1a和Cel1b是胞内p-葡萄糖苷酶,属于糖苷水解酶第1家族。转录组学数据显示,这三个p-葡萄糖苷酶在纤维素和乳糖诱导条件下转录上调最为显著,是瑞氏木霉最主要的p-葡萄糖苷酶,它们在瑞氏木霉纤维素酶基因诱导表达过程中的作用有待于进一步的研究。大多数糖苷水解酶第1家族的p-葡萄糖苷酶同时具有p-半乳糖苷酶活性,是乳糖胞内代谢酶的重要候选蛋白,瑞氏木霉第1家族的p-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b是否具有乳糖水解活性以及它们在乳糖诱导纤维素酶表达过程中是否发挥作用目前还不清楚。为了深入阐释瑞氏木霉三个主要的β-葡萄糖苷酶Bgl1/Cel3a、Cel1a和Cel1b在纤维素酶基因诱导表达过程中的作用,我们将这三个β-葡萄糖苷酶的编码基因分别进行了敲除以及组合多敲除。详细研究了β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株响应纤维素、纤维二糖、槐糖以及乳糖等碳源表达纤维素酶的能力,对瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶影响纤维素酶诱导表达的机制进行了分析。同时研究了瑞氏木霉两个糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b对乳糖的水解和转化作用,并分析了Cel1a和Cel1b对乳糖诱导纤维素酶表达的影响及其发挥作用的机制。本论文的主要创新结果如下：1.对瑞氏木霉三个主要β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1/cel3a, cel1a以及cel1b进行基于同源重组原理的基因敲除,同时构建了多基因缺失菌株△cel1a△cel1lb和△tripG,以研究不同β-葡萄糖苷酶的生物学功能。为了研究不同β-葡萄糖苷酶的功能,我们通过同源双交换的手段构建了一系列β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株△cel1a,△cel1b,△cel1a△cel1b和△tripG(bgll, cel1a和cel1b同时缺失),锚定PCR以及Southern blot验证了基因敲除以及单拷贝整合。我们进一步分析了不同β-葡萄糖苷酶的缺失对瑞氏木霉胞内外β-葡萄糖苷酶总酶活的影响。在纤维素培养条件下,与野生型菌株相比△cel1b菌株胞内β-葡萄糖苷酶酶活只有轻微下降,而△cel1a菌株胞内β-葡萄糖苷酶酶活下降75%,△cel1a△cel1b菌株胞内β-葡萄糖苷酶酶活与△cel1a菌株类似,说明Cella是胞内主要的β-葡萄糖苷酶,Cel1b对胞内总β-葡萄糖苷酶酶活的贡献不大。Bgl1/Ce13a缺失后瑞氏木霉胞外β-葡萄糖苷酶活性仅有10%残留,说明Bgl1/Ce13a是瑞氏木霉胞外最主要的β-葡萄糖苷酶。2.比较了不同β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株在纤维素以及槐糖上的生长和纤维素酶诱导表型,证明在不溶性纤维素诱导条件下纤维素酶基因的快速诱导表达需要β-葡萄糖苷酶的参与。我们首先研究了瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶是否参与不溶性纤维素诱导纤维素酶表达的过程。通过测定不同β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株在纤维素培养过程中的生长曲线,我们发现β-葡萄糖苷酶的缺失影响菌株对纤维素的利用。此外,在纤维素诱导条件下β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株发酵液中总蛋白量和纤维素酶酶活均比野生型菌株低。我们进一步使用Northern blot和qRT-PCR的方法研究了纤维素诱导条件下不同β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株纤维素酶基因cbh1的转录动力学。结果显示瑞氏木霉野生型菌株在纤维素诱导3h之后cbh1转录即可达到较高水平,而△cel1b菌株需要诱导6h,△cel1a菌株需要诱导24h,△cel1a△cel1b菌株需要诱导36h,△triβG菌株则需要诱导48h才能达到与野生型类似的水平。β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株发酵液中CBHI的表达也呈现与转录类似的结果。与纤维素不同,槐糖诱导条件下△cel1a△cel1b菌株cbhl转录动力学与野生型一致,说明β-葡萄糖苷酶在槐糖诱导纤维素酶表达过程中并未发挥重要作用。综上所述,我们证明了这三个β-葡萄糖苷酶在瑞氏木霉菌株快速响应纤维素启动纤维素酶表达过程中发挥了重要作用,它们有可能参与了诱导物的合成。3.通过分析在纤维二糖诱导条件下瑞氏木霉主要β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株的纤维素酶表达表型,证明主要β-葡萄糖苷酶的缺失能提高纤维二糖对纤维素酶的诱导能力,瑞氏木霉主要β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的转化作用在纤维素酶诱导表达过程中并未发挥重要作用。作为纤维素的主要降解产物,纤维二糖在低浓度下也可以诱导瑞氏木霉产生纤维素酶,而且有证据显示瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶能够在体外将纤维二糖通过转糖基作用转化为槐糖这一强效诱导物。为了分析瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在纤维二糖诱导纤维素酶表达过程中发挥的作用,首先我们摸索了在瑞氏木霉中纤维二糖诱导纤维素酶表达的最佳浓度。实验确定0.25%(w/v)纤维二糖为最佳诱导浓度。其次我们通过Western blot测定了β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株发酵液中CBHI表达量,并使用qRT-PCR检测了菌体纤维素酶cbhl基因的转录水平,结果显示在纤维二糖诱导条件下β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株中纤维素酶的表达水平明显高于野生型,说明降低瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶的活性能提高纤维二糖诱导纤维素酶表达的能力,瑞氏木霉主要的β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的转化作用在纤维素酶的诱导表达过程中并未发挥重要作用。最后,我们在纤维素培养过程中外源添加一定比例的纤维二糖,发现β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株快速响应纤维素产生纤维素酶的能力得到恢复,表明β-葡萄糖苷酶可能通过调控胞外纤维二糖的水平影响纤维素诱导条件下纤维素酶基因的快速表达。4.证明瑞氏木霉胞内主要β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b在乳糖诱导纤维素酶表达过程中发挥重要作用。Cel1a和Cel1b的缺失影响纤维素酶基因转录调控因子Xyrl的表达,但是组成型回补表达Xyr1并不能恢复β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株响应乳糖产生纤维素酶的能力。瑞氏木霉糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶是乳糖胞内代谢酶的重要候选蛋白,因此我们分析了β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b是否影响菌体对乳糖的利用以及乳糖诱导纤维素酶基因的表达。通过生长曲线的测定,我们发现胞内p-葡萄糖苷酶的缺失影响菌体在乳糖碳源上的生长,但是并不影响菌体对半乳糖的利用。通过Western blot分析乳糖培养条件下β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株发酵液中纤维素酶CBHI的表达,我们发现β-葡萄糖苷酶基因cel1a的缺失导致乳糖诱导纤维素酶表达延迟,而在双缺菌株△cel1a△cel1b中纤维素酶的表达完全缺失。进一步通过qRT-PCR分析纤维素酶基因cbh1的转录发现β-葡萄糖苷酶基因缺失菌中纤维素酶表达的滞后或缺失发生在转录层面,说明瑞氏木霉胞内β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b对乳糖诱导纤维素酶表达是必需的。Xyr1是调控纤维素酶基因诱导表达的关键转录因子,因此我们分析了β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株中xyr1基因的转录水平,实验发现虽然β-葡萄糖苷酶的缺失造成xyr1基因的转录水平降低,但在△cel1a△cel1b菌株中组成型表达xyr1并不能恢复菌株响应乳糖产生纤维素酶的能力。上述结果表明胞内β-葡萄糖苷酶在乳糖诱导纤维素酶表达过程中发挥了重要作用,β-葡萄糖苷酶不仅影响了关键转录因子Xyr1的表达,还通过其他途径影响乳糖诱导纤维素酶表达的过程,β-葡萄糖苷酶发挥作用的机制还需要进一步的分析。5.通过分析Cel1a和Cel1b重组蛋白的底物特异性,证明瑞氏木霉糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶具有乳糖水解活性和转化活性。糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶往往具有β-半乳糖苷酶活性,瑞氏木霉糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b可能在乳糖胞内代谢过程中发挥作用。因此我们通过大肠杆菌异源表达和纯化了瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b,并对其底物特异性进行了分析。我们发现Cel1a和Cel1b不仅能够水解纤维二糖及其类似物pNPG,还能够水解乳糖类似物DNPG,证明其具有β-半乳糖苷酶活性。通过HPLC分析β-葡萄糖苷酶Cel1a与乳糖反应的产物,我们发现除了D-葡萄糖和D-半乳糖,还有其他半乳寡糖产生,表明β-葡萄糖苷酶Cel1a可能具有乳糖转糖基活性。瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶具有的这种糖苷水解活性在纤维素酶诱导表达过程中的作用还需要进一步的研究。6.证明了瑞氏木霉主要β-葡萄糖苷酶具有的糖苷水解活性对乳糖诱导纤维素酶表达是必需的。为了进一步分析瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b所具有糖苷水解活性对乳糖诱导纤维素酶表达的影响,我们在瑞氏木霉△cel1a菌株中组成型表达了野生型Cel1a蛋白以及水解活性缺失点突变体Cel1a (Q367A)蛋白。在乳糖诱导条件下,组成型回补野生型Cel1a蛋白使得△cel1a菌株cbh1的转录得到恢复,cbh1转录起始时间甚至比野生型提前,cbh1转录量也有所升高,而回补水解活性缺失点突变体Cella (Q367A)蛋白的菌株cbh1转录并未恢复,转录起始时间与野生型相比仍然有明显的滞后,这些结果说明Cel1a的糖苷水解活性对乳糖诱导纤维素酶的表达是必需的。为了进一步分析β-葡萄糖苷酶具有的乳糖水解活性在纤维素酶诱导表达过程中的作用,我们在△cel1a菌株中组成型表达了乳酸克鲁维酵母来源的胞内β-半乳糖苷酶Lac4,结果显示回补Lac4并不能恢复△cel1a菌株纤维素酶基因cbh1的转录,表明仅有乳糖胞内水解活性并不足以启动纤维素酶的诱导表达,Cel1a还通过其他途径对纤维素酶基因的诱导表达产生影响。