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心血管疾病是目前全球诱发死亡最多的一类疾病,例如主动脉瘤、动脉粥样硬化、肺动脉高压等。血管重构是这些疾病的共同的病理基础,尤其是来自血管平滑肌层的重构。这其中活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）的大量生成及其下游关键酶的失活是导致血管重构的关键。NADPH氧化酶是机体生成ROS的关键酶,NADPH氧化酶4（Nox4）在血管系统表达最为丰富,是过氧化氢的主要来源。肌浆网/内质网钙ATP酶（sarcoplasmic/endoplasimic reticulum calcium ATPase,SERCA）是维持细胞内钙稳态的关键酶。SERCA2是血管中SERCA的主要亚型,位于第674位的半胱氨酸（cysteine 674,C674）是调控SERCA2活性的关键氧化还原位点。在生理情况下,C674上的巯基在一氧化氮的作用下发生谷胱甘肽化修饰,增加SERCA2活性。在有大量ROS生成的病理情况下,C674被不可逆性氧化（C674-SO3H）,阻碍了该位点的谷胱甘肽化修饰,干扰SERCA2功能。在血管平滑肌,Nox4是导致SERCA2中C674不可逆性氧化的关键ROS来源。本课题从血管平滑肌角度探讨了Nox4参与主动脉瘤和动脉粥样硬化的作用机制,以及SERCA2中C674的不可逆性氧化失活参与肺血管重构的作用机制。第一部分:平滑肌Nox4在血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）诱导的主动脉瘤和动脉粥样硬化中的作用机制。骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、Ⅰ＆Ⅲ型胶原蛋白（collagen Ⅰ＆Ⅲ,Col Ⅰ＆Ⅲ）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）2和血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule1,VCAM1）是参与血管重构的关键蛋白。在主动脉平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMC）,Ang Ⅱ显著上调Nox4、OPN、MMP2、Col Ⅰ＆Ⅲ和VCAM1的表达。推测Ang Ⅱ通过上调这些血管重构相关蛋白促进主动脉瘤和动脉粥样硬化的进程。在主动脉SMC,我们发现抑制Nox4减少OPN、MMP2、Col Ⅰ＆Ⅲ的表达,而过表达Nox4增加OPN、MMP2和Col Ⅰ＆Ⅲ的表达,表明Nox4直接调控这些血管重构相关蛋白的表达。在主动脉SMC,给与外源性OPN增加MMP2、Col Ⅰ＆Ⅲ和VCAM1的表达,推测OPN介导了平滑肌Nox4对这些血管重构相关蛋白的调控。在人的主动脉瘤和Ang Ⅱ诱导的小鼠主动脉瘤和动脉粥样硬化样本中,平滑肌层Nox4和OPN表达增加,推测平滑肌Nox4可能通过调控OPN参与主动脉瘤和动脉粥样硬化进程。在FVB/N遗传背景,我们构建了在平滑肌上特异性过表达人Nox4的显性负性突变体（smooth muscle specific overexpression of human Nox4 dominant negative,SDN）小鼠来拮抗一些病理情况下平滑肌Nox4的表达上调。在Ang Ⅱ诱导的主动脉瘤和动脉粥样硬化模型中,与同窝对照非转基因（non-transgenic,NTg）小鼠相比,SDN小鼠的主动脉瘤发生率、瘤体个数和瘤体大小都明显降低,主动脉瘤胶原沉积和弹力纤维断裂减少;油红O阳性染色的粥样斑块面积减小。在主动脉和主动脉SMC,与NTg小鼠相比,SDN小鼠的OPN、MMP2、Col Ⅰ＆Ⅲ表达减少。在SDN小鼠的主动脉SMC,给与外源性OPN增加MMP2、Col Ⅰ＆Ⅲ和VCAM1的表达,促进细胞增殖、迁移和巨噬细胞对SMC的粘附,进一步证明了OPN介导平滑肌Nox4对这些血管重构相关蛋白的调控。这些结果表明,病理情况下上调的平滑肌Nox4直接参与了主动脉瘤和动脉粥样硬化的发生,其中的重要机制之一是通过上调OPN来促进血管重构相关蛋白的表达,导致血管重构。第二部分:SERCA2中C674的不可逆性氧化失活引起肺血管重构的机制研究。肺高压（pulmonary hypertension,PH）是一组常见的心肺血管重塑疾病,以肺血管重构为主要病理特征,严重威胁人类健康。ROS与肺血管重构以及PH密切相关,但具体调控机制尚不清楚。我们发现SERCA2中C674-SO3H在缺氧诱导的PH中明显增加,推测缺氧引起大量生成的ROS通过不可逆性氧化C674,造成C674这一氧化还原位点的失活,干扰SERCA2功能,从而促进肺血管重构和PH。为了探讨SERCA2中C674的不可逆氧化失活与肺血管重构和PH的关系,我们将674位的半胱氨酸突变为丝氨酸（C674S）,在C57BL/6J背景SERCA2 C674S基因突变敲入（SERCA C674S mutant knock-in,SKI）小鼠来模拟病理情况下C674的失活。与同窝野生型（wild type,WT）小鼠相比,SKI小鼠的右心室收缩压（right ventricular systolic pressure,RVSP）、右心室舒张末期压力（right ventricular end diastolic pressure,RVEDP）以及右心室肥厚指数随年龄的增长而上升。SKI小鼠发生明显的肺血管重构且随年龄加剧。SKI小鼠的肺血管重构在组织学上主要表现为:肺动脉中膜层增厚,肺小动脉肌化,肺动脉中膜增殖指标Ki67阳性染色的比例增加,肺动脉新内膜增生,肺动脉丛状病变,肺动脉血栓形成,肺静脉肥厚。肺动脉SMC（pulmonary artery smooth muscle cells,PASMC）参与了绝大多数的肺血管重构。因此我们从PASMC角度探讨了SERCA2中C674失活调控肺血管重构的机制。在PASMC,C674失活不影响SERCA2的m RNA和蛋白表达水平,这其中SERCA2b是主要基因型。C674失活增加胞内Ca2+浓度,说明C674失活干扰了SERCA2的功能。C674失活增加细胞周期相关蛋白的表达,包括细胞周期蛋白（cyclin）（A1、A2、B1）和细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）（CDK 1和CDK 2）,加速细胞周期,促进细胞增殖,推测C674失活通过增加这些细胞周期相关蛋白的表达,加速细胞周期促进PASMC的增殖。C674失活诱导内质网应激,主要是激活肌醇需要酶1α（inositol-requiring enzyme-1α,IRE1α）-剪切型X-盒结合蛋白1（spliced X-box-binding protein-1,XBP1s）通路。在WT的PASMC,过表达XBP1s增加细胞周期相关蛋白的表达,促进细胞增殖。在SKI的PASMC,内质网应激抑制剂4-PBA、IRE1α-XBP1s通路的抑制剂4μ8C、SERCA2的激活剂CDN1163均可以减少XBP1s和细胞周期相关蛋白的表达,抑制细胞周期和细胞增殖。在WT的PASMC,过表达SERCA2a和SERCA2b的C674突变体（S674）均激活IRE1α-XBP1s通路,促进细胞增殖,说明SERCA2a和SERCA2b中C674位点的失活都参与了对PASMC增殖的调控。在SKI的PASMC,过表达SERCA2b抑制IRE1α-XBP1s通路,抑制细胞增殖,说明SERCA2b在抑制PASMC增殖中非常关键。体内给药实验中,我们发现4μ8C和CDN1163可以明显改善SKI小鼠肺血管重构,抑制肺组织中XBP1s和细胞周期相关蛋白的表达。这进一步证明SERCA2中C674失活通过激活IRE1α-XBP1s通路,增加细胞周期相关蛋白的表达,促进细胞增殖,引起肺血管重构。综上所述,我们探讨了血管平滑肌中Nox4来源的ROS及受其氧化还原调控的SERCA2中C674的不可逆性氧化失活在血管重构中的作用机制。在主动脉,OPN介导了病理情况下上调的平滑肌Nox4对血管重构相关蛋白的调控和Ang Ⅱ诱导的主动脉瘤和动脉粥样硬化的进程。在肺血管,C674失活通过激活IRE1α-XBP1s通路,促进细胞增殖和肺血管重构。针对血管平滑肌Nox4和SERCA2及其下游通路的干预改善病理情况下的血管重构。