Nramp（natural resistance associated macrophage protein,天然抗性相关巨噬细胞蛋白）家族蛋白是一类广泛存在于生物界、能转运不同金属离子的跨膜蛋白家族,尤其是二价微量金属离子,例如锌、锰、铁和铜等离子。米曲霉作为食品安全级的真菌,近年来在食品发酵、酿造和生物制剂等行业得到了广泛的应用。其中米曲霉次级代谢产物曲酸因其具有抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性、抑菌能力和抗癌功效,被广泛应用于食品、医药、化妆品、农业和工业等各个领域。本论文研究内容包括米曲霉AoNramp1基因的鉴定、米曲霉遗传转化菌株的构建、AoNramp1过表达和敲除菌株功能分析以及AoNramp1基因对曲酸合成的影响,研究结果有:1.为了鉴定米曲霉AoNramp1基因,我们通过跨膜结构域预测、多序列比对和系统发育分析等生物信息学手段来鉴定分析AoNramp1转运蛋白。通过Blast比对结果表明,在米曲霉中仅有一个Nramp蛋白家族基因,命名为AoNramp1（Ao090003001119）。通过跨膜结构域预测以及多序列比对分析,发现AoNramp1转运蛋白含有11个跨膜区,在多序列比对时发现大部分的曲霉属真菌具有高度相似的序列,且在跨膜区8和9之间有一段共有转运序列,这是Nramp转运蛋白的特有基序,表明Nramp蛋白在曲霉属真菌中可能具有相似的功能。利用系统发育分析时,Nramp蛋白在大部分的曲霉属真菌之间的同源性较高,且高度保守。2.构建稳定、高效且易于操作的米曲霉筛选标记是对米曲霉进行遗传改造首要考虑的问题。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除米曲霉3.042的pyr G基因,构建了米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型菌株。这为后面研究AoNramp1基因在米曲霉中的功能表征以及探究AoNramp1基因与曲酸合成之间的关系奠定了基础。3.通过对AoNramp1在不同离子处理下的表达模式分析,结果显示:在对照组中,在培养的整个过程中AoNramp1基因的表达均被上调。在锌处理条件下培养的2到4天,AoNramp1的表达被显著诱导,但是在培养的第7天被抑制。与锌处理相似,在整个锰处理中,AoNramp1被强烈诱导并相对于野生型对照显著增加。铁和铜处理下,在整个培养过程中,AoNramp1的表达模式与对照组之间没有显著性差异。为了进一步研究AoNramp1的表达模式,使用AoNramp1起始密码子的2.0 kb上游片段与GUS（β-葡糖醛酸糖苷酶）报告基因融合生成了一个报告载体。GUS染色实验结果表明,锌处理2天后,GUS-PAoNramp1菌株检测到GUS活性,并且随着处理时间的延长,GUS信号变得更强。培养4天后,锰处理观察到GUS信号。铁和铜在整个处理中没有检测到GUS活性。结果表明锌和锰处理会诱导AoNramp1启动子的表达。4.为了探究AoNramp1基因过表达以及敲除对米曲霉生长的影响,我们分别用不同金属离子对野生型、AoNramp1过表达和敲除菌株进行处理。结果显示,在对照组中,相比于野生型菌株,无论是生长直径还是孢子数目都受到了明显的抑制。在锌、锰、铁和铜处理下,AoNramp1过表达和敲除菌株的生长直径都受到了明显抑制。在孢子数目方面,铜和锰处理表现出与对照组相一致的表型;铁处理时,野生型、AoNramp1过表达和敲除菌株之间孢子数目不存在显著性差异;锌处理下,过表达菌株孢子数量相比野生型明显减少,而敲除菌株孢子数量相比野生型不存在显著性差异。在EGTA和Mn/EGTA处理下,野生型、AoNramp1过表达和敲除菌株的生长直径均趋于一致,但是在加入锰之后缓解了EGTA对各菌株的胁迫作用;在孢子数量上,过表达菌株相比于野生型有所减少,敲除菌株相比于野生型没有显著差异。结果表明,AoNramp1过表达和敲除菌株的生长相较于野生型菌株会受到抑制。5.为了探究AoNramp1基因对米曲霉曲酸合成的影响,我们根据GUS染色的结果分别做了三组处理:对照、锌处理和锰处理。结果表明,在对照组中,过表达和敲除菌株的曲酸产量虽有所下降,但两者之间并不存在显著性差异;在锌处理时,野生型、过表达和敲除菌株的曲酸产量都有显著性上调,趋势与对照组一致,三者之间均不存在显著性差异。此外,相对于对照组,野生型的曲酸产量提高了2.6倍,敲除和过表达菌株曲酸产量分别提高了3.6倍和4.7倍。在锰处理时,与对照组也极为相似,野生型、过表达和敲除菌株的曲酸产量都有所上调,但AoNramp1过表达和敲除菌株与野生型菌株的曲酸产量存在显著性差异。相对于对照组,野生型曲酸产量提高1.4倍,敲除和过表达菌株曲酸产量分别提高1.5倍和1.4倍。结果表明,米曲霉曲酸生物合成不受AoNramp1基因的影响。