研究背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是最常见的心血管疾病之一,它的发病机理一直是心血管领域的研究热点。动脉粥样硬化斑块好发于血管分叉、弯曲及狭窄等部位。局部剪切力的变化与斑块分布特异性密切相关。在血管平直区域,平稳的血流产生方向单一的生理性脉冲剪切力(剪切力≥12dyne/cm2),具有抑动脉粥样硬化形成的保护作用。而在血管分叉等处,涡流产生,血流变为方向紊乱,速度明显降低的震荡剪切力(剪切力0±4dyne/cm2),这一剪切力则具有促动脉粥样硬化形成的作用。内皮细胞覆盖于整个血管腔,直接接触血流,长期处于血流剪切力的刺激下,能够感受血流力学的变化,传递信号,维持血管稳态。内皮细胞功能紊乱是动脉粥样硬化形成早期的关键步骤。DKK家族是进化过程中十分保守的基因家族,主要包括DKK1、DKK2、 DKK3及DKK4四个成员,其中DKK1的研究最为广泛。DKK1是经典Wnt/β-catenin通路的分泌型抑制剂,可与细胞膜上Krumen、LRP5/6等受体结合,阻碍正常Wnt受体复合物的形成,促进胞质中β-catenin的磷酸化降解,影响下游相关基因的表达,关闭Wnt通路,进而影响相应的生物学功能。既往研究发现,DKK1与心血管疾病的发生密切关系。冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清及人的颈动脉及冠状动脉斑块中高表达的DKK1均提示DKK1与动脉粥样硬化相关。但是,DKKI在动脉粥样硬化的发生发展中所起的作用及相关机制尚不清楚,剪切力刺激下内皮细胞中DKK1的表达有着怎样的变化亦未见报道。研究目的1.探讨不同剪切力对血管内皮细胞中DKK1表达的调节作用；2.明确DKK1在不同剪切力调节内皮细胞黏附功能及内皮细胞间紧密连接相关分子表达中的作用；3.体内实验明确DKK1在病理剪切力作用区域动脉粥样硬化发生中的作用及相关分子机制,研究方法1.体外人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)的提取与培养无菌条件下获取一段长约15-20cm的剖宫产新生儿脐带,利用胰酶消化法提取脐静脉内皮细胞,以10% M199培养基重悬于小号细胞培养瓶中,培养于37℃、5%C02孵箱中,次日换液,清除未贴壁细胞。待细胞长至融合,传代继续培养。2.体外不同剪切力干预体外培养至4-7代的HUVECs用于剪切力干预实验。载玻片高压灭菌,包被I型鼠尾胶原,HUVECs种于其上,待细胞密度达到约90%,分别给予静止培养或3、6、12、24小时的生理性脉冲剪切力或病理性震荡剪切力刺激,观察不同剪切力对内皮细胞中DKK1表达的影响。3.小鼠颈总动脉部分结扎模型的构建通过小鼠颈总动脉部分结扎建立左侧颈总动脉病理剪切力模型,体内实验进一步观察不同剪切力对血管内皮细胞中DKK1表达的影响。8周龄雄性C57BL/6小鼠麻醉后,于颈部正中切开皮肤,钝性分离左颈总动脉,找到其四个分支,手术线结扎左颈内动脉、左颈外动脉及左头臂动脉,保留左甲状腺上动脉血流通畅。术后第二天行小鼠颈动脉超声观察术后左颈总动脉的血流情况,48小时后取材行蛋白质印迹检测已证实受剪切力调控的相关分子的表达变化,评估造模是否成功。4.小鼠主动脉及颈总动脉en face免疫荧光染色(1)小鼠主动脉取材：正常的8周龄雄性C57BL/6小鼠经腹腔麻醉、心脏灌流、4%甲醛溶液固定后,分离主动脉弓及胸主动脉,大体解剖显微镜下去除血管周围的结缔组织,纵行剖开主动脉弓及胸主动脉,进行en face染色。(2)小鼠颈总动脉取材：左侧颈总动脉部分结扎术后48小时,手术组及假手术对照组C57BL/6小鼠经麻醉,灌注及固定后,行左侧颈总动脉取材,镜下去除周围结缔组织,纵向剖开,以行en face染色。en face免疫荧光染色步骤如下：将剖开的主动脉弓及颈总动脉置于含0.5%Triton X-100的PBS溶液中通透10分钟,封闭,一抗4℃孵育过夜,相应的荧光二抗孵育,DAPI染核,激光共聚焦显微镜下观察并留取照片。5.细胞转染5.1 DKK1 siRNA转染细胞转染的DKK1 siRNA及阴性对照siRNA均由上海吉玛生物技术公司合成,转染依照lip2000说明书进行,转染6小时后更换培养基,依照实验分别给予细胞相应的刺激,转染24-48小时后进行相应检测。5.2 DKKl基因过表达慢病毒载体的构建及转染DKK1基因过表达慢病毒载体及携带绿色荧光蛋白GFP的空载体均由上海吉凯基因化学技术有限公司合成,转染依照慢病毒操作手册进行,转染48小时后,荧光显微镜观察转染效率。6.实时荧光定量PCR分析Trizol法提取HUVECs及组织中的总RNA,浓度测定后,利用TaKaRa公司的逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA。依照TaKaRa公司的SYBR Green使用说明配置体系,进行实时荧光定量PCR检测。引物购自上海吉玛生物技术公司。7.蛋白质印迹法(Western Blotting, WB)利用RIPA提取相应的HUVECs及组织蛋白,煮沸变性,SDS-PAGE电泳,湿转法转膜,5%牛奶封闭,一抗4℃孵育过夜,洗膜,相应的二抗常温孵育,化学发光,分析蛋白条带灰度值。8.免疫荧光染色不同刺激后的HUVECs,经固定、封闭后,一抗4℃孵育过夜,相应的荧光二抗37℃避光孵育1小时,染核、封片,激光共聚焦显微镜下观察。9.单核细胞黏附实验人单核／巨噬细胞系购自ATCC,悬浮培养于10% RPMI-1640培养基中。HUVECs刺激结束前15分钟,羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记单核细胞,标记后的单核细胞与相应的HUVECs于37℃孵箱中共培养1小时,PBS洗去未结合的单核细胞,荧光显微镜下观察计数,统计分析。10.慢病毒转染干扰DKKI表达对病理剪切力作用区域AS发生的影响10.1小鼠DKKl基因干扰慢病毒载体的构建构建小鼠DKK1基因干扰的shRNA慢病毒载体(shRNA-DKK1),以携带绿色荧光蛋白GFP的慢病毒空载体作为阴性对照。10.2颈总动脉部分结扎AS模型的构建及相关病理学检测90只8周龄雄性ApoE-/-小鼠经2周适应性喂养后过渡至高脂喂养,分为以下三组：(1)Con组(n=30)：尾静脉注射100μ1生理盐水；(2)Scramble组(n=30)：尾静脉注射10μl,5×107ifu的空载体病毒悬液；(3)shRNA-DKK1组(n=30)：尾静脉注射100μl,5×107ifu的shRNA-DKK1病毒悬液。转染2周后,荧光显微镜观察小鼠颈总动脉冰冻切片中GFP荧光强度,实时荧光定量PCR及Western Blotting检测小鼠颈总动脉组织中DKK1表达情况,评估慢病毒转染效率。剩余小鼠全部行左侧颈总动脉部分结扎手术构建病理剪切力模型,继续高脂喂养。1周后,每组随机选取16只小鼠,行左侧颈总动脉en face染色观察血管内皮与血液循环中单核细胞的黏附情况及血管内皮细胞间紧密连接相关分子的表达变化,行Western Blotting检测DKK1干扰对内皮细胞黏附及紧密连接相关分子表达的影响。其余小鼠于手术结扎后3周给予安乐死,留取左侧颈总动脉,制备冰冻切片,HE及油红O染色检测DKK1干扰对病理剪切力作用区域AS发生的影响。10.3长期高脂喂养AS模型的构建及相关病理学检测30只8周龄雄性ApoE-/-小鼠经2周适应性喂养过渡至高脂喂养后平均分为三组,同急性AS模型组,即Con组,Scramble组及shRNA-DKK1组,每组10只。转染后继续高脂喂养,每隔1个月追加一次尾静脉注射。3个月后给予小鼠安乐死,留取主动脉弓,制备冰冻切片,油红O染色观察DKKI干扰对主动脉弓小弯侧及其分叉处血流紊乱区域AS发生的影响。11.统计分析实验数据均以均数±标准误表示,数据统计分析应用SPSS 16.0软件进行。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较运用ANOVA单因素方差分析,P<0.05认为存在显著统计学差异。研究结果1.病理剪切力上调小鼠血管内皮细胞中DKK1的表达小鼠主动脉弓小弯侧血管内皮主要承受促动脉粥样硬化的病理性震荡剪切力及低剪切力,而胸主动脉直段血管内皮承受抑动脉粥样硬化的生理性脉冲剪切力。主动弓小弯侧内皮细胞中DKK1表达量明显高于胸主动脉直段(P<0.05)。小鼠左侧颈总动脉部分结扎建立病理剪切力模型,与假手术组相比,手术组颈总动脉内皮细胞中DKK1表达明显上调(P<0.05)。说明在体内,促动脉粥样硬化的病理性剪切力可以上调血管内皮细胞中DKK1的表达。2.脉冲剪切力下调HUVECs中DKK1的表达,震荡剪切力上调HUVECs中DKK1的表达与静止对照组相比,脉冲剪切力下调内皮细胞中DKK1 mRNA及蛋白表达,脉冲剪切力作用3小时及6小时DKK1表达下调有统计学意义(P<0.05)；震荡剪切力上调内皮细胞中DKK1 mRNA及蛋白表达,与静止对照组相比,震荡剪切力作用6小时及12小时DKK1表达上调有统计学意义(P<0.05)。分别给予HUVECs脉冲剪切力或震荡剪切力刺激6小时,免疫荧光染色显示,脉冲剪切力刺激后HUVECs中DKK1表达量显著降低(P<0.05),而震荡剪切力刺激后HUVECs中DKK1的表达量则显著升高(P<0.05)。3.DKK1参与不同剪切力对内皮细胞黏附功能的调节与静止对照组相比,脉冲剪切力抑制内皮细胞对单核细胞的黏附(P<0.05),下调内皮细胞中黏附分子VCAM1、ICAM1及E-selectin的表达(P<0.05)；而过表达DKK1,与空载体阴性对照相比,能够阻断脉冲剪切力对内皮细胞与单核细胞黏附的抑制作用(P<0.05),上调内皮细胞中VCAM1、ICAM1及E-selectin黏附分子的表达(P<0.05)。与静止对照组相比,震荡剪切力促进内皮细胞对单核细胞的黏附(P<0.05),上调内皮细胞黏附分子VCAM1、ICAM1及E-selectin的表达(P<0.05)；DKK1siRNA转染能够下调内皮细胞中VCAM1、ICAM1及E-selectin的表达(P<0.05),阻断震荡剪切力对内皮细胞与单核细胞黏附的促进作用(P<0.05)。4.DKK1参与不同剪切力对内皮细胞间紧密连接相关分子表达的调节与静止对照组相比,脉冲剪切力上调内皮细胞间紧密连接相关分子ZO1、Z02、occludin及Claudin 5的表达(P<0.05)；而过表达DKK1,与空载体阴性对照组相比,上述分子的表达均下调(P<0.05)。与静止对照组相比,震荡剪切力下调内皮细胞间紧密连接相关分子ZO1、ZO2、occludin及Claudin 5的表达(P<0.05)；而干扰DKK1表达,上述分子的表达均上调(P<0.05)。5.DKK1干扰抑制病理剪切力作用区域AS的发生慢病毒转染后2周,ApoE-/-小鼠颈总动脉内有明显的GFP表达。与Con及Scramble对照组相比,shRNA-DKK1组小鼠颈总动脉中DKK1 mRNA及蛋白表达水平均明显下调(P<0.05),说明转染安全有效。高脂喂养,颈总动脉部分结扎术后3周,ApoE-/-小鼠结扎侧(左侧)颈总动脉中有明显的AS斑块生长。与Con对照组相比,shRNA-DKKl组AS斑块病变范围显著降低(P<0.05)。高脂喂养3个月,ApoE-/-小鼠主动脉弓小弯侧及主动脉弓分支处病理剪切力作用区域可见明显斑块生长。与Con对照组相比,shRNA-DKK1组上述部位AS斑块病变范围显著下降(P<0.05)。6.DKK1干扰抑制ApoE-/-小鼠病理剪切力作用区域血管内皮与单核细胞黏附颈总动脉部分结扎术后1周,与Con对照组相比,shRNA-DKKl组ApoE-/-小鼠结扎侧(左侧)颈总动脉血管内皮与单核细胞的黏附显著降低,内皮黏附分子VCAM1、ICAM1及E-selectin的表达亦显著下调(P<0.05)。7.DKK1干扰上调ApoE-/-小鼠病理剪切力作用区域血管内皮细胞间紧密连接相关分子的表达左侧颈总动脉部分结扎术后1周,Western Blotting及en face免疫荧光染色结果均显示,与Con对照组相比,shRNA-DKK1组小鼠血管内皮细胞间紧密连接相关分子ZO1、ZO2、occludin及Claudin 5的表达均显著上调(P<0.05)。结论1.脉冲剪切力下调血管内皮细胞中DKK1表达,震荡剪切力上调其表达；2.DKK1参与不同剪切力对血管内皮细胞黏附功能及内皮细胞间紧密连接相关分子表达的调节；3.DKK1能够通过促进血管内皮与单核细胞的黏附及下调内皮细胞间紧密连接相关分子的表达促进病理剪切力作用区域动脉粥样硬化斑块的发生。研究背景动脉粥样硬化斑块好发于血管分叉、分支及狭窄等病理性震荡剪切力及低剪切力作用区域,内皮细胞位于血管壁管腔内面,直接暴露于血流剪切力刺激下,能够感受局部环境的变化并传递力学信号,影响相关基因的表达。内皮细胞功能紊乱是早期动脉粥样硬化发生的重要步骤。内皮细胞表面(管腔面、细胞间连接处及基底面)具有众多的力学感受器,这些分子被活化后能够同时激活细胞内多条信号转导通路,影响多种核转录因子与相关基因剪切力反应元件(Shear stress responsive elements,SSREs)的结合,进而影响相应的细胞功能。在血管分叉等震荡剪切力及低剪切力作用区域,内皮细胞中具有抑动脉粥样硬化作用的基因表达被抑制,而促动脉粥样硬化相关基因表达上调,进而促进该区域动脉粥样硬化的发生与发展。临床研究报道DKK1与动脉粥样硬化疾病密切相关。我们的前期工作发现病理性的震荡剪切力上调内皮细胞中DKK1的表达,加速内皮细胞与单核细胞的黏附及内皮细胞间紧密连接相关分子的表达下调,进而促进病理剪切力作用区域动脉粥样硬化的发生。但震荡剪切力调节内皮细胞中DKK1表达的分子机制尚不清楚。DKK1除了作为Wnt/β-catenin通路的抑制剂外,同时还是β-catenin的靶基因。β-catenin能够与其辅激活蛋白TCF/LEF核转录因子结合,调节DKK1的表达。蛋白酶激活受体1(Protease activated receptorl, PAR1)是一种七次跨膜G蛋白偶联受体,能够参与内皮细胞炎症反应及血管通透性等过程的调节。研究发现,PAR1能够活化黑色素瘤细胞中的环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB),上调其黏附分子MCAM/MUC18的表达,促进肿瘤转移。PAR1/CREB通路以及P-catenin分子是否能够介导震荡剪切力对内皮细胞中DKK1表达的调节尚未见报道。近年来,长链非编码RNA (Long non-coding RNA, LncRNA)的作用受到关注。LncRNA参与细胞分化、表观遗传以及细胞凋亡等细胞内多种过程的调控。新近的研究发现,LncRNA分子NBAT1能够通过调节乳腺癌细胞中DKKl的表达,进而影响乳腺癌的远处转移。NBAT1是否能在内皮细胞中介导震荡剪切力对DKK1的调节有待研究证实。研究目的1.明确β-catenin在震荡剪切力调节内皮细胞DKK1表达中的作用；2.明确PAR1/CREB通路在震荡剪切力对内皮细胞DKK1表达调节中的作用；3.明确内皮细胞中LncRNA NBAT1在震荡剪切力对DKK1表达调节中的作用及其与β-catenin及PAR1/CREB通路的关系。研究方法1.人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)的体外提取与培养无菌条件下获取剖宫产新生儿脐带,胰酶消化法提取脐静脉内皮细胞,重悬于10% M199培养基中,置于37℃、5%CO2孵箱中培养,24小时后换液。待细胞长至融合,传代培养。2.体外不同剪切力干预体外培养至4-7代的HUVECs接种于高压灭菌,提前包被I型鼠尾胶原的载玻片上。待细胞密度达到约90%,给予静止培养或0.5、1、3、6小时震荡剪切力干预,观察震荡剪切力对内皮细胞中β-catenin、PAR1、CREB及NBAT1表达的影响,并找到适宜的刺激时间,用于后续研究。3.细胞转染细胞转染所用的β-catenin、PAR1、CREB、NBAT1以及阴性对照siRNA均由上海吉玛生物技术公司合成,依照lip2000转染步骤进行转染,6小时后更换培养基,依照实验给予细胞相应的刺激,转染后24-48小时行相应检测。4.实时荧光定量PCR利用Trizol法进行HUVECs中总RNA的提取,浓度测定后,利用TaKaRa公司的逆转录试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA。依照TaKaRa公司的SYBR Green使用说明配置体系,进行实时荧光定量PCR检测。引物均购自上海吉玛生物技术公司。5.蛋白质印迹法(Western Blotting, WB)利用RIPA进行HUVECs蛋白的提取,蛋白样本煮沸变性后,行SDS-PAGE电泳,转膜,5%牛奶封闭,一抗孵育,洗膜,相应的二抗孵育及化学发光,获得蛋白条带后利用Photoshop CS5进行蛋白条带灰度值分析。6.荧光原位杂交(Fluorescencein situ hybridization,FISH)LncRNA NBAT1原位杂交探针以及相应的FISH试剂盒均自锐博生物公司购入,操作依照试剂盒提供的步骤进行。待检测的内皮细胞经4%多聚甲醛固定及通透后,加入NBAT1原位杂交探针杂交过夜,次日洗去未结合的探针,染核、封片后进行荧光检测。7.统计分析实验数据均以均数±标准误表示,数据统计分析应用SPSS 16.0软件进行。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较运用ANOVA单因素方差分析,P<0.05认为存在显著统计学差异。研究结果1.β-catenin参与震荡剪切力对HUVECs中DKKl的上调分别给予HUVECs不同时间的震荡剪切力刺激,Western Blotting结果显示与静止对照组相比,震荡剪切力干预组HUVECs中p-β-catenin含量下降,β-catenin的表达上调。siRNA转染干扰β-catenin表达,Western Blotting检测发现震荡剪切力干预下HUVECs中DKK1的表达上调被抑制,提示β-catenin参与震荡剪切力对内皮细胞中DKK1的表达调节。2. PAR1/CREB通路参与震荡剪切力对HUVECs中DKKl的上调Western Blotting检测震荡剪切力干预不同时间,内皮细胞中PAR1及CREB的表达变化,结果显示：与静止对照组相比,震荡剪切力上调HUVECs中PAR1的表达,促进CREB的表达及磷酸化。分别进行相应siRNA转染干扰PAR1及CREB的表达,均可发现震荡剪切力对内皮细胞中DKK1的表达上调被抑制。同时,PAR1 siRNA干扰或加入PAR1抑制剂后,与阴性对照组相比,内皮细胞中CREB的表达及磷酸化均被抑制,提示震荡剪切力干预下,PAR1能够通过调节CREB的表达及活化影响DKK1的表达。3.NBAT1参与介导震荡剪切力对内皮细胞中DKK1表达的调节震荡剪切力分别干预HUVECs不同时间,实时荧光定量PCR检测结果发现,与静止对照组相比,震荡剪切力干预下NBAT1的表达显著上调(P<0.05)。给予内皮细胞震荡剪切力干预6小时,FISH结果显示NBAT1主要表达于细胞核中,与静止对照组相比,震荡剪切力显著上调其表达。NBAT1 siRNA转染,HUVECs中震荡剪切力对DKK1的上调被抑制(P<0.05),提示NBAT1参与介导震荡剪切力对内皮细胞中DKK1的表达调节。4. NBAT1不通过影响β-catenin的蛋白表达介导震荡剪切力对DKKl的调节给予]HUVECs siRNA转染干扰NBAT1表达,Western Blotting检测细胞中β-catenin的表达变化,发现NBAT1干扰对P-catenin的蛋白含量没有显著影响,提示NBAT1不通过影响β-catenin的蛋白表达参与震荡剪切力对DKK1的调节。5.NBAT1通过PAR1/CREB通路介导震荡剪切力上调DKKl的表达NBAT1 siRNA转染干扰其表达,给予震荡剪切力刺激,Western Blotting检测PAR1与CREB的表达变化以及CREB磷酸化水平的改变,结果显示：NBAT1干扰后,震荡剪切力刺激下PAR1、CREB的表达及CREB的磷酸化水平的上调均被抑制,提示NBAT1能够通过PAR1/CREB通路参与介导震荡剪切力对内皮细胞中DKK1的表达调节。结论(1)β-catenin参与震荡剪切力对内皮细胞中DKK1的上调；(2)NBAT1能够通过活化PAR1/CREB通路介导震荡剪切力对DKK1的表达调节。