第一部分携带HCCS1的多调控腺病毒特异性靶向肝癌的研究　　肝癌是严重危害人类健康的第三大类癌症，治疗肝癌具有很重要的意义。之前的研究表明缺失E1B55KD基因的溶瘤腺病毒ZD55携带杀伤基因后形成的基因-病毒具有很好的抑制肿瘤生长的效果，然而在肿瘤治疗的过程中，提高病毒的使用量时要求其安全性要进一步提高，因此本实验试图结合使用多种调控因素来提高溶瘤腺病毒的特异性，包括引入肝癌特异性元件AFP启动子，达到特异性靶向治疗肝癌的目的。我们将腺病毒的复制密切相关的基因E1A的启动子替换成肿瘤特异性启动survivin promoter(SP)，同时缺失E1A上的RB结合位点对应的24个碱基，另外缺失与腺病毒的复制相关的E1B55KD基因。由于使用多种特异性调控元件在提高腺病毒的安全性的同时，会在一定程度上降低腺病毒的有效性，因此我们在此基础上缺失了与Bcl-2同源的E1B19KD基因，从而构建产生了腺病毒Ad.SP-E1A(Δ24)-ΔE1B19K-ΔE1B55K，简称为Ad.SPDD。为了增强溶瘤病毒的杀伤作用，我们引入了对肝癌具有杀伤作用的HCCS1基因，使用AFP启动子控制HCCS1的特异性表达，同时引入WPRE元件提高HCCS1的表达量，形成了Ad.SPDD-AFP-HCCS1-WPRE-SV40，命名为Ad.SPDD-HCCS1。将构建产生的多调控腺病毒与原来的单调控腺病毒ZD55比较后发现，Ad.SPDD在复制能力和细胞毒性方面，其安全性均得到了提高，同时对肝癌细胞Huh-7的杀伤能力有了一定程度的提高。构建形成的Ad.SPDD-HCCS1具有肝癌选择性杀伤作用，并能在裸鼠移植瘤模型上表现出良好的抑瘤效果。在细胞水平上的检测上，Ad.SPDD-HCCS1是通过引起肝癌细胞凋亡而产生细胞毒性，进一步的研究表明Ad.SPDD-HCCS1可以通过引起线粒体膜电位的改变引起细胞的凋亡。本研究构建产生的溶瘤基因病毒Ad.SPDD-HCCS1能特异性靶向肝癌，提供了肝癌组织特异性治疗的方法，具有很好的应用前景。　　第一章携带TRAIL的溶瘤病毒靶向治疗肺癌干细胞的研究　　癌症转移、复发以及癌细胞对化疗、放疗的抗性是癌症治疗中所面临的比较棘手的问题，而癌症细胞中一小群叫做癌症干细胞的细胞，对这些特性的产生起着决定性的作用。癌症干细胞是一群处于静息状态的细胞，并且其表面有ABC家族蛋白可以将进入细胞的小分子泵出细胞外，而表现出对化疗放疗等治疗手段的抗性，因此消灭癌症干细胞是治疗癌症的关键。溶瘤腺病毒可以感染静息期细胞并复制、裂解细胞，并且不能被细胞表面的ABC泵泵出细胞外，是一个很好的靶向癌症干细胞的手段。本部分工作主要在肺癌细胞系A549细胞上研究了溶瘤基因-病毒在靶向癌症干细胞中作用。我们在无血清并添加生长因子的培养条件下，培养A549细胞，获得了A549 sphere细胞，并对A549 sphere细胞进行癌症干细胞特性方面的鉴定。与A549细胞相比，A549 sphere细胞具有更强的化疗药物耐受性，更多处于G0/G1期，增殖速度更慢，培养在有血清的培养基中后能分化到A549细胞的状态，并且在裸鼠体内有更强的成瘤性能，因而A549sphere细胞是一群具有癌症干细胞特性的细胞。我们使用溶瘤腺病毒ZD55-EGFP感染A549细胞，A549 sphere细胞，并检测了溶瘤病毒ZD55-TRAIL在体外对A549 sphere细胞杀伤作用，引起A549 sphere细胞死亡的方式及在体内对A549sphere细胞形成的肿瘤的抑制作用。结果发现，ZD55-EGFP可以很好的感染并能杀伤A549 sphere细胞，ZD55-TRAIL对A549 sphere细胞的杀伤要比ZD55-EGFP更强，ZD55-TRAIL能够促进A549 sphere细胞发生线粒体途径的凋亡，并能在体内很好的抑制A549 sphere细胞形成的肿瘤的生长。通过体外和体内实验，我们证明了溶瘤基因-病毒ZD55-TRAIL能很好的抑制具有癌症干细胞特性的A549 sphere细胞的生长，是一个很好的靶向肺癌干细胞的工具。　　第二章 CD24不能作为肺癌干细胞的表面标志　　肺癌是致死率最高的一种癌症，严重危害着人类的健康，而肺癌干细胞是肺癌的转移，复发，化疗放疗抗性等特性的根源，因此消灭肺癌干细胞对治疗肺癌具有很重要的意义。研究靶向肺癌干细胞的药物的前提是具备肺癌干细胞，本实验试图通过寻找肺癌干细胞的表面的标志为获得肺癌干细胞提供便利。在本部分工作中，我们利用第一章中成球培养获得的具有癌症干细胞特性的A549 sphere细胞，通过检测其表面蛋白的变化，发现CD133+，CD44+的A549细胞的比例几乎没有发生变化，而CD24-细胞则在A549 sphere细胞中有着很大程度的富集，另外我们发现肺癌细胞系H460细胞和H1299细胞在成球培养后，也有很高比例的CD24-细胞。此外，A549 sphere细胞在有血清条件下培养后，其富集的高比例的CD24-细胞会恢复到A549细胞的比例，具备分化的特性。我们进一步使用化疗药物cisplatin和5-FU处理A549细胞，发现CD24-细胞的比例增多。在进一步确认CD24-是否是肺癌干细胞的实验中，我们通过流式分选获得了A549 CD24+和CD24-的细胞，发现A549 CD24-细胞比A549 CD24+细胞的增殖速度更慢，克隆形成实验中形成的克隆更小，并且具有抵抗5-FU的特性，然而在CD24-体外分化的实验中，我们发现A549 CD24+细胞和A549 CD24-细胞呈现出不稳定的结果。在裸鼠和NOD/SCID小鼠体内成瘤实验中，A549 CD24-细胞的成瘤能力反而不如A549 CD24+细胞，而H460 CD24-细胞和H460 CD24+细胞则具有相似的成瘤能力。因此我们认为肺癌CD24-细胞虽然在体外表现出一定的癌症干细胞的特性，但是不能被看作为肺癌干细胞，CD24不能作为一个标志用作指示或分选肺癌干细胞。尽管我们的工作没有找到一个很好的肺癌干细胞表面标志，但却明确指出了CD24不能作为肺癌干细胞的标志，为其他科研人员提供了便利，同时还为其他研究人员提供一种思路，癌症干细胞的表面标志的鉴定过程中可能会存在体外现象和体内现象不一致的情况，不能以局限数据草率下结论而影响到进一步的靶向肺癌干细胞的药物研发。　　第三部分乙酰胆碱酯酶在基因-病毒治疗系统中的应用　　乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是分解神经递质乙酰胆碱的酶，近年来发现它在细胞的凋亡中起着重要的中介作用，并有报道它在某些种类癌症病人的癌组织中有低表达的情况，因此我们猜想可能可以用它来诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗肿瘤的目的。我们检测了多种器官来源的癌症中的癌组织和癌旁组织中AChE的水平，发现AChE在胃癌，胰腺癌等癌症的癌组织中的表达水平比癌旁组织低。我们通过稳定转染AChE基因，使用非复制性病毒携带AChE和使用复制性病毒ZD55携带AChE分别检测了AChE对胃癌细胞及其他来源的癌细胞的作用。研究发现，稳定转染AChE基因不能抑制胃癌细胞系AGS细胞的生长，也不能促进AGS细胞对化疗药物敏感，而稳定转染AChE可以抑制肝癌细胞SMMC7721的生长。然而，AChE基因以非复制性腺病毒为载体时能够抑制胃癌细胞的生长，并且能抑制多种其他类型的肿瘤细胞的活力，但是却对原代培养获得的成纤维细胞没有毒副作用。使用复制性病毒携带AChE的ZD55-AChE对胃癌细胞的杀伤作用明显强于Ad.AChE和ZD55，对其他来源的多种肿瘤细胞也有杀伤作用，而对成纤维细胞几乎没有影响。在进一步的研究中发现，ZD55-AChE可以诱导AGS细胞发生凋亡，并且是依赖于caspase的，另外，ZD55-AChE可以引起AGS细胞的线粒体膜电位发生改变，说明ZD55-AChE能引起AGS细胞发生线粒体途径的凋亡。在胃癌细胞MGC80-3形成的移植瘤模型中，ZD55-AChE具有很好的抑制肿瘤生长的作用。通过本实验，我们证明了AChE可以用作治疗基因来治疗癌症，溶瘤基因-病毒ZD55-AChE具有强大的抑制胃癌的能力，并且具有一定的广谱性，是一个用作癌症治疗的很好的潜在药物。