论文部分内容阅读
MicroRNA（miRNA）是一类长约22个核苷酸的非编码小RNA分子,主要通过与Ago蛋白家族和其它分子组成RISC复合体,结合到靶mRNA的3’ UTR区域,抑制靶基因翻译或导致mRNA降解。现有研究表明,miRNA在流感病毒复制、感染和致病过程中发挥重要作用,参与调控了流感病毒强致病性及病毒性肺炎的病理过程。miRNA也参与了血管内皮细胞功能的调节,在病毒感染血管内皮细胞通透性升高中发挥了重要的作用。但目前对于流感病毒感染的血管内皮细胞中miRNA的变化没有详细的报道。前期实验证明,流感病毒感染大鼠肺微血管内皮细胞,通过激活PKC通路,Rho/ROCK通路和p38MAPK通路引起ERM蛋白磷酸化,从而使细胞骨架变构,应力纤维增加,最终造成细胞通透性增加。但目前对miRNA分子在流感病毒所致微血管内皮细胞屏障功能破坏中的作用尚未明确。中医认为,流感病因主要为外感风邪异毒,或内里正气虚弱,导致肺卫功能失常,其病位在肺卫,而主要在卫表。黄芪作为补中益气的要药,入肺补益肺气,临床上可治疗肺部相关疾病,常用于治疗气虚引起的感冒。研究表明,黄芪及其主要成分黄芪多糖和黄芪总黄酮可保护内皮细胞、调节机体免疫机能,具有抗炎和抗病毒的作用。毛蕊异黄酮作为黄芪总黄酮主要成分之一,生物学活性广泛,能抑制LPS引起的HUVEC内细胞骨架重构,对低渗造成的内皮细胞通透性升高具有保护作用。然而,毛蕊异黄酮对流感病毒感染的HUVEC细胞内通透性升高的影响尚未可知。目的脐静脉内皮细胞株（HUVEC）常用来研究内皮细胞功能,我们拟通过miRNA芯片和RT-PCR实验检测并鉴定流感病毒感染HUVEC中miRNA的变化,以筛选出参与流感病毒诱导血管内皮细胞功能变化中的差异表达miRNA分子,预测并鉴定miRNA调控的靶基因,以探讨miRNA分子在流感病毒感染血管内皮细胞中的骨架变构及通透性升高过程中的作用。同时,检测毛蕊异黄酮对流感病毒感染HUVEC通透性及细胞内F-actin的变化,以及对miRNA的影响,探究毛蕊异黄酮是否具有改善流感病毒所致内皮细胞通透性升高的作用及可能的机制,为靶向治疗病毒性肺炎及指导临床用药提供理论基础。方法1 流感病毒所致脐静脉内皮细胞通透性升高的研究利用间接免疫荧光法,检测流感病毒对脐静脉内皮细胞的感染率,确定感染HUVEC细胞的流感病毒株及病毒稀释度。利用内皮细胞跨膜电阻法检测PR8和CA07感染HUVEC细胞后Oh、2h、6 h、12 h、24 h和36 htranswell小室的电阻值,激光共聚焦检测PR8和CA07感染12 h和24 h后HUVEC细胞内F-actin的分布,TUNEL法检测PR8和CA07感染后12 h HUVEC细胞的凋亡。2流感病毒感染HUVEC中microRNA的筛选与验证实验中设正常组、PR8组和CA07组,PR8和CA07分别感染HUVEC细胞12h和24h后Trizol法提取总RNA，利用miRNA芯片分析HUVEC细胞内miRNA的表达谱,对病毒感染后HUVEC细胞内表达差异的miRNA进行靶基因预测,挑选出8个关键miRNA分子,利用实时定量PCR验证这些miRNA分子表达是否与芯片结果一致。3 毛蕊异黄酮对流感病毒感染HUVEC细胞通透性升高及关键microRNA的影响利用MTT法检测毛蕊异黄酮对HUVEC和MDCK细胞的毒性和抗病毒活性。30 MOI PR8感染HUVEC细胞后,给予20 mg/ml毛蕊异黄酮,内皮细胞跨膜电阻法检测不同时间点HUVEC细胞跨膜电阻值,激光共聚焦检测细胞内F-actin的分布,qRT-PCR检测细胞中 has-miR-92a-1-5p 和has-miR-29b-1-5p 的表达。结果1 流感病毒所致脐静脉内皮细胞通透性升高的研究1.1 1 MOI的流感病毒感染HUVEC,感染后24 h,对四种不同病毒株（A/PR/8/1934（HIN1）、A/Ca/07/2009（HIN1）、A/BJ/501/2009（HIN1）、A/BJ/HZ01/2011）感染率的检测结果分别约为10%,15%,8%,3%。1.2分别以0.1 MOI、1 MOI、10MOI的流感病毒（PR8）感染HUVEC,感染后24h对不同MOI的PR8感染率的检测结果分别约为5%,13%,41%。1.3分别以20 MOI、30 MOI、40 MOI的PR8感染HUVEC,分别于12 h和24 h检测感染率,12 h感染率分别为32%、46%、51%,24 h感染率分别为50%、62%、68%。1.4 30MOI流感病毒（PR8和CA07）感染HUVEC细胞后12h及24h,HUVEC通透性升高,细胞内F-actin变构。1.5流式细胞术检测结果显示,30 MOI流感病毒（PR8和CA07）感染HUVEC细胞后24 h,正常组细胞和病毒组细胞凋亡率没有显著性差别。2流感病毒感染HUVEC中microRNA的筛选与验证2.1感染后12h,PR8和正常组相比,有30个miRNA表达具有明显差异,其中17个miRNA表达降低,13个表达升高。感染后24h,与正常组相比,有198个miRNA表达具有显著性差异,其中126个表达降低,72个表达升高。12 h和24 h有4个miRNA的表达均出现显著差异。2.2感染后12h,CA07和正常组相比,有305个miRNA表达具有明显差异,其中146个miRNA表达降低,159个表达升高。感染后24h,与正常组相比,有262个miRNA表达具有显著性差异,其中198个表达降低,64个表达升高。其中,12h和24h有129个miRNA的表达均出现显著差异。2.3经过对比,12 h时间点PR8和CA07感染HUVEC细胞,引起细胞中miRNA发生变化,其中具有显著性差异的miRNA重合了 3个。24 h时间点,两株病毒引起HUVEC细胞中miRNA变化,具有显著性差异的重合了 66个。2.4 KO和KEGG富集结果显示,参与调控的miRNA分子涉及多条通路,对应多个靶基因。预测参与内皮细胞通透性调控的靶基因有PKC,ROCK1,CAMKⅡ,actin等,参与的调控通路有PKC通路,Rho/ROCK通路,Ca2+通路等。因此,我们根据芯片检测和靶基因预测结果,选取了靶基因为参与调控内皮细胞通透性信号通路的关键分子的8个miRNA。2.5采用RT-PCR对miRNA表达进行验证,验证结果显示,12h时间点,病毒组HUVEC细胞内表达差异显著的 miRNA 有 has-miR-138-5p（P<0.05）,has-miR-21-5p（P<0.01）,has-miR-29a-3p（P<0.01）,has-miR-200a-3p（P<0.01）和 has-miR-181a-5p（P<0.001）,与正常组相比,显著降低。感染后24 h,病毒组与正常组相比,表达显著性降低的miRNA 为 has-miR-181a-5p（P<0.01）,has-miR-29b-1-5p（P<0.001）和 has-miR-147b（P<0.001）;而has-miR-138-5p,has-miR-99a-5p虽表达下调但不具有显著性差异。3 毛蕊异黄酮对流感病毒感染HUVEC细胞通透性升高及关键microRNA的影响3.1毛蕊异黄酮对HUVEC和MDCK细胞的最大无毒浓度分别为40 μg/ml、80μg/ml,细胞存活率约为90%以上。3.2毛蕊异黄酮浓度为20 μg/ml时,能抑制流感病毒所致HUVEC细胞通透性升高。3.3毛蕊异黄酮浓度为20 μg/ml时,能调节流感病毒感染的HUVEC细胞中F-actin重构。3.4毛蕊异黄酮浓度为10 μg/ml、20μg/ml、40 μg/ml时,不具有抗病毒活性。3.5毛蕊异黄酮能增加流感病毒感染的HUVEC细胞中has-miR-92a-1-5p和has-miR-29b-1-5p的表达。结论1 流感病毒感染HUVEC细胞,引起细胞内F-actin重构,导致内皮细胞通透性升高。模型条件:用30 MOI的PR8或CA07感染HUVEC细胞,选取两个时间点分别为12 h 和 24 h。2 根据靶基因预测结果挑选8个miRNA分子进行实时定量PCR验证,miRNA变化趋势与芯片结果一致。推测这8个miRNA的靶基因可能参与调控了流感病毒感染的内皮细胞通透性的升高。3 毛蕊异黄酮浓度为20 μg/ml,能抑制流感病毒感染的HUVEC细胞内F-actin的重构和通透性升高,且不具有抗病毒活性,同时上调细胞内has-miR-29b-1-5（P<0.05）和has-miR-92a-1-5p的表达。因此,毛蕊异黄酮具有改善流感病毒所致内皮细胞通透性升高的作用,保护内皮细胞功能,且该过程与毛蕊异黄酮的抗病毒作用无关。该过程可能通过has-miR-29b-1-5p参与调控,需要进行功能验证试验进一步确认。