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随着现在人们工作节奏加快,过度性疲劳的病症严重困扰着大量年轻人;由于现在人们的不良饮食结构和生活习惯,心脑血管等血栓性疾病在老年人当中的发病率也与日俱增。但目前市面上还尚未有安全可靠的可食性产品来帮助人们改善这两种多发病症。因此,本文对抗凝血和抗疲劳活性肽的深入研究探讨则显得非常有实用意义。宽体金线蛭、东亚钳蝎蛋白质含量高,是一种理想的制备活性多肽的原料。本文以宽体金线蛭、东亚钳蝎为原料,提取分离蛋白,通过酶法可控制备抗凝血、抗疲劳活性多肽,建立了最佳酶解工艺条件,并进行动物体内功效论证,再进行后续的分离纯化、多肽序列测定,分析探讨了氨基酸组成变化与多肽活性之间的关系,最后模拟多肽在体内胃肠道的消化吸收实验。采用碱溶酸沉法对宽体金线蛭、东亚钳蝎蛋白进行了较高得率的提取。HPLC分析表明,宽体金线蛭分离蛋白WPI的分子量分布主要集中在4230 Da到92362 Da,东亚钳蝎分离蛋白HPI的分子量分布主要集中在27510 Da到52436 Da范围。采用酶制剂Alcalase AF 2.4L,Trypsin,Papain,Pepsin,Protamex,Flavourzyme等,探讨了WPI和HPI的酶解工艺。Alcalase分别酶解WPI和HPI至DH为19%和18%时,所得产物抗凝血活性最高,IC50值分别达到12.65±1.53 mg/m L和23.65±2.44 mg/m L。WA的分子量主要集中在大于5733 Da和723-3238 Da范围,HA则主要集中在3024-4872Da,989-2053 Da和377-856 Da。对酶解产物WA和HA的抗凝溶栓功效采用动物体内模型进行了评价。在预防注射角叉菜胶诱发的血栓形成上,中剂量组WA(WA-M)和HA(HA-M)均显示了显著的作用(p<0.05),但高剂量较之中剂量,其预防效果的增加并不显著(p>0.05)。低、中、高剂量的两种产物WA和HA均具有延长小鼠血浆APTT、PT值的效果。其中高剂量组WA和HA的喂养,能使小鼠血液APTT、PT值达到最大。本实验所得两种产物肽的灌喂均能显著影响小鼠体内血液的凝固性。采用体外抗氧化体系评价了WA和HA的抗氧化活性功效。WA和HA对自由基DPPH·均有较高的清除能力,IC50值分别达到0.42±0.03 mg/m L和0.91±0.08 mg/m L;对自由基·OH的清除上,WA(89.3±2.5%)表现出了比HA(53.4±3.1%)更强的能力(p<0.05);两者在提供自由电子促使Fe3+还原为Fe2+的过程当中,也具有显著的还原能力;WA和HA(1.2 mg/m L)对AAPH导致的红细胞过氧性溶血抑制率分别高达82.81%和60.50%,说明它们可以清除掉AAPH溶液产生的过氧化自由基,对血红细胞起到保护作用。采用动物体内抗运动性疲劳模型全面评价了两种产物的抗运动性疲劳功效。中(8.5mg/10 g)、高(25 mg/10 g)剂量组WA,HA的灌胃均能显著延长运动小鼠的力竭游泳时间,且WA效果优于HA。WA-M,WA-H,HA-H能显著保持肝糖原含量(p<0.05);WA-M,WA-H使血清中乳酸含量比空白组降低了16.55%和31.11%;WA-L,WA-M和HA-L能抑制血清中部分BUN的产生;中、高剂量的WA和HA均显著降低血清中CK的活力,起到有效保护肌肉细胞,另外,只有高剂量组的WA和HA才对血清SOD酶活性有显著提高作用,分别提高21.52%和9.32%。不同剂量WA的抗疲劳功效指标均优于HA,且在本实验的多数指标里,抗疲劳功效与给样剂量存在一定的正相关性。对上述酶解产物WA和HA接着依次通过离子交换色谱、凝胶过滤色谱、制备型RP-HPLC进行了分离技术,得到两种纯化产物WA3-1和HA18-3-B-8。抗凝血活性IC50值分别为0.12 mg/m L,0.012 mg/m L。MALDI-TOF-TOF MS结果表明,WA3-1序列为NH2-His-Asp-Phe-Leu-Asn-Asn-Lys-Leu-Glu-Tyr-Glu-COOH(Mr:1422.0 Da),HA18-3-B-8序列为NH2-Val-Glu-Pro-Val-Thr-Val-Asn-Pro-His-Glu-COOH(Mr:1119.8 Da)。经体外模拟胃肠道消化试验后,两组多肽组分仍保持较高的抗凝血活性。通过模拟纯化后多肽的序列,人工合成了高纯度的活性肽WP20和WP21。Caco-2细胞模型体外模拟吸收试验结果表明,随着培养时间延长,无论从UR到DR,还是DR到UR,WP20和WP21的转运量均存在增加趋势。本文成功制备了两种既具备良好抗凝血活性,又显示出了较大抗疲劳功效的产物多肽,并得到了抗凝血纯化肽的结构序列。这不仅为活性肽产品的开发提供了理论依据,而且也丰富了活性肽的结构—功能理论。