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当家蚕免疫系统受到免疫信号刺激后,通过激活Toll或Imd信号通路的关键核转录因子Dorsal/Dif或Relish产生抗菌肽而发生免疫应答。免疫刺激去除后,Toll或Imd信号通路的关键核转录因子活性需要受到抑制,从而降低或阻止抗菌肽的产生来维持免疫稳态和机体平衡。在果蝇中已报道多种降低或阻止免疫系统核转录因子活性或稳定性的免疫稳态调控分子,突变或敲除这些分子导致免疫系统过度激活。免疫稳态调控的研究有助于更全面的了解免疫系统,而家蚕免疫系统的研究尚未涉及免疫稳态调控分子。本实验通过生物信息学方法,在家蚕中鉴定了多个可能参与免疫稳态调控的分子;通过病原微生物诱导感染家蚕后,研究这些分子在多种免疫器官中的诱导表达模式;通过在细胞水平上过表达或干涉BmFAF2,检测经免疫诱导后家蚕抗菌肽的表达量变化;并在个体水平上千涉BmFAF2后,检测经病原微生物感染后家蚕存活率的变化情况,以及检测家蚕抗菌肽的表达量变化,从而研究BmFAF2调节免疫稳态的机制;主要研究结果如下:
1、家蚕免疫稳态调控分子的鉴定
基于家蚕基因组数据库,我们初步筛选到了免疫稳态分子BmWnt、BmUbc9、BmFAF2和BmPOSH等基因。家蚕中包含wnt结构域的分子共9个,对应的编号分别是BGIBMGA006145、BGIBMGA006146、BGIBMGA006147、BGIBMGA006148、BGIBMGA007580、BGIBMGA006004、BGIBMGA013783、BGIBMGA013787和BGIBMGA013981;Ubc9所对应的编号为BGIBMGA005425与BGIBMGA010222;FAF2所对应的编号为BGIBMGA008874;POSH所对应的编号为BGIBMGA012467。
2、家蚕免疫稳态分子的表达模式分析
通过时期表达谱分析发现BmWnt、BmUbc9、BmFAF2和BmPOSH在家蚕整个发育时期均有表达。通过几种病原微生物诱导家蚕后,我们研究了免疫稳态分子BmWnt、BmUbc9、BmFAF2和BmPOSH的表达模式。研究发现不同基因在同一组织或同一基因在不同组织的表达模式有所差异,但总体规律表现为:在受病原微生物感染初期的6-12h这些基因的表达量保持在较低的水平,在感染的中后期这些基因的表达量表现为短暂迅速上升,然后表达量迅速下降到正常水平或正常水平以下。
3、BmFAF2的功能研究
我们构建了BmFAF2基因的真核表达载体并合成了该基因的干涉dsRNA。通过将BmFAF2基因的真核表达载体和干涉dsRNA转染BmE细胞发现,当家蚕BmE细胞受脂多糖(LPS)诱导后,过表达BmFAF2会阻碍BmAttacinA、BmMoricinA和BmcecropinA三种抗菌肽的表达,干涉BmFAF2后会促进BmAttacinA和BmMoricinA的表达。存活率试验结果显示,BmFAF2基因干涉组经病原微生物诱导后的存活率明显大于对照组,对照组中注射ddH2O和dsRed的实验组存活率大致相同。并且在干涉BmFAF2基因后,家蚕在受病原微生物感染时抗菌肽的表达水平明显升高。表明FAF2在家蚕中作为免疫稳态分子,可以抑制免疫系统的激活。
我们还构建了BmRelish的真核表达载体,在BmRelish上添加了Myc标签,用于进一步的研究BmFAF2在Imd信号通路中的调控作用。