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研究背景： 肝纤维化是一种常见的影响人类健康的慢性进行性肝病；原位肝移植是目前公认治疗终末期肝病唯一有效的方法，但是由于供体器官来源困难、手术并发症、免疫排斥、价格昂贵等原因限制了肝移植的临床应用。因此亟待寻找新的有效治疗肝病的方法。近年来，随着干细胞移植技术的兴起，并且由于其来源丰富、创伤性小、操作简单等优点，有望成为肝病治疗的新手段。 间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是中胚层来源的一类成体多能干细胞，其除了具有能够向中胚层和非中胚层细胞的多向分化潜能和高度自我更新能力，此外还具有靶向归巢、免疫调节和主动适应并改造微环境等生物学特性，使MSCs能够应用于多种损伤组织的修复治疗。胎盘来源的间充质干细胞与骨髓来源的MSCs有相似的生物学特性，但又具有无伦理学限制、来源丰富、非侵入性易获取、扩增分化能力高、免疫抑制的特性等优势，可作为种子细胞进行细胞移植。 研究目的： 本实验设计的主要目的是采用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）标记的人胎盘来源的间充质干细胞（human placental mesenchymal stem cells,hPMSCs）移植入四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）诱发的肝纤维化大鼠模型，进行体内示踪，疗效评价，并进行初步的机制探讨。 研究方法： 选取本课题组冻存的第三代 hPMSCs，复苏后继续培养传代至细胞达到稳定状态，待融合度达到50-60％时利用慢病毒进行转染，构建表达 GFP的人胎盘间充质干细胞（GFP+hPMSCs）；六周龄的SD雄性大鼠，采用50%CCl4橄榄油溶液，按照0.5ml/100g皮下注射，每周2次，持续8周，建立大鼠肝纤维化模型；随机选取五只造模大鼠做病理切片，检测造模情况。大鼠随机分为以下三组：GroupⅠ（生理盐水对照组），造模时皮下注射生理盐水替代四氯化碳，尾静脉注射3-6代的GFP+hPMSCs，剂量为2.0×106/1ml生理盐水/只；GroupⅡ（GFP+hPMSCs移植治疗组），造模成功后尾静脉注射3-6代的GFP+hPMSCs，剂量为2.0×106/1ml生理盐水/只；GroupⅢ（肝纤维化模型组），造模成功后尾静脉不注射细胞只注射生理盐水1ml/只。在GFP+hPMSCs移植后的1周、4周、8周和12周处死大鼠，取肝脏，收集血清；然后，采用H&E、Sirius red和Masson’s trichrome染色以及肝脏弹性成像技术进行大鼠肝纤维化程度判断；并且，应用血清学检测方法检测 ALB、ALT、AST、ALB、LN、HA，观察 GFP+hPMSCs移植对大鼠肝功能的影响以及对肝纤维化的改善情况。 采用荧光成像技术和免疫组织化学染色以及RT-PCR检测ALB、AFP、CK18在大鼠肝组织中的表达，确定GFP+hPMSCs移植在大鼠肝脏中的定植及定向分化潜能；采用免疫组织化学染色和qRT-PCR方法检测a-SMA、TGF-β1蛋白与mRNA在大鼠肝组织中的表达，进行初步机理研究。 研究结果： 本研究成功构建了表达GFP的人胎盘间充质干细胞；H&E、Sirius red和Masson’s trichrome染色结果显示：CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型成功建立；与肝纤维化模型组相比，GFP+hPMSCs移植治疗组纤维组织增生程度、肝脏纤维化评分、纤维组织的沉积量均明显降低；肝脏弹性成像值表现了相似的结果， GFP+hPMSCs移植治疗组中 Metavir评分明显降低；血清学检测结果显示：与肝纤维化模型组相比，GFP+hPMSCs移植治疗组的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）水平显著降低；而白蛋白（ALB）的血清水平增加；GFP+hPMSCs移植治疗组的层粘连蛋白（LN）和透明质酸（HA）的血清水平均低于肝纤维化模型组。 肝脏荧光成像和免疫组织化学染色以及RT-PCR显示：GFP+hPMSCs移植治疗组中，在 GFP+hPMSCs移植后的4个时间点均检测到荧光信号；在GFP+hPMSCs移植后1周，在任何肝脏样品中均未观察到AFP，ALB和CK18。然而，移植后4周、8周和12周，在大鼠所有肝组织中均检测到AFP，ALB， CK18的表达，但表达量随时间降低；免疫组织化学染色和qRT-PCR的结果显示：与肝纤维化模型组相比，GFP+hPMSCs移植治疗组中的a-SMA和TGF-β1表达水平显著降低，并且随时间的延长而降低。 结论：GFP+hPMSCs移植能够明显缓解大鼠肝纤维化程度，显著改善模型大鼠肝功能，明显降低胶原的含量，降低a-SMA和TGF-β1的表达水平，可明显抑制肝星状细胞的活化。