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研究背景白癜风(vitiligo)是一种皮肤科常见病,是获得性的皮肤色素异常,主要表现为多发性脱色性白斑。其发病呈现逐年上升的趋势。主要因为皮肤、毛发中功能性黑素细胞减少或消失而表现为白斑。许多学者就黑素细胞减少的原因所进行的研究结果,提出了几种主要观点,包括氧化应激、免疫介导、遗传、黑素细胞自噬以及神经精神因素等,但到目前为止关于白癜风的病因和确切的发病机制有待继续研究,尚未完全阐明。近年来自身免疫学说受到越来越多的关注。有研究发现白癜风中CD8+T细胞可以特异性的识别表皮黑素细胞,并产生细胞毒性作用,其外周血中CD8+T细胞数量显著升高,病理下也发现白癜风皮损局部表皮和真皮有大量CD8+T细胞浸润,而且目前已发现CD8+T细胞反应的强度随着疾病严重的增加而增加,这些证据表明CD8+T是白癜风黑素细胞的破坏的主要效应环节。同时,研究发现白癜风患者外周血中调节性T细胞(Treg)的数量显著减少,并且存在功能缺失,使Treg/CD8+T的比例失调,导致细胞免疫紊乱,可能是白癜风发病的另一个重要原因。这些研究都强烈提示CD8+T细胞和Treg细胞在白癜风的发病中发挥重要的作用。微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs))是一类小的保守的非编码RNA分子,长度约为19-24个核苷酸。这些miRNAs通常靶向一个或者多个信使RNA(mRNA),能在转录后与靶基因的3’-非翻码区(3’-UTR)的互补序列相结合,使mRNAs降解或者抑制靶基因的翻译,被认为是哺乳动物转录后基因调节的关键调节剂。miRNA-155是来源于活化的淋巴细胞及单核/巨噬细胞内高表达的非编码转录产物,是一个典型的多功能基因。miRNA-155参与免疫细胞的发育和成熟、免疫应答中的调控,在肿瘤的发生发展中也有重要作用。近期有研究发现miR-155在白癜风患者皮损的黑素细胞和角质形成细胞中异常表达,提示miR-155可能参与白癜风的发病,但其具体作用机制尚不明确。另外,有研究发现miRNA-155可调节Treg的分化,还可上调Treg的标志性分子Foxp3的水平。因此,我们推测,miRNA-155是否可以通过调控Treg细胞的增殖分化和功能,抑制CD8+T淋巴细胞的活化及其对黑色素细胞的损伤,从而通过免疫途径对黑素细胞起到保护作用。目的1.研究白癜风患者和健康人的外周血T细胞中miRNA-155表达水平的差异;2.研究miRNA-155对白癜风患者Treg细胞分化与功能的调节作用;3.分析miRNA-155调节Treg细胞后在白癜风患者CD8+T细胞活化和凋亡中的作用;4.探讨miRNA-155调节Treg细胞后对白癜风患者黑素细胞的作用。方法1.分选白癜风患者和健康人外周血总T细胞收集在温州医科大学附属第一医院皮肤科门诊诊断的9例非节段性活动期白癜风患者和6例健康人体。首先采用密度梯度离心法提取患者和健康人的外周血单个核细胞。然后采用CD3抗体分选CD3+T细胞(总T细胞);2.qRT-PCR检测白癜风患者和健康人的外周血T细胞中miRNA-155的表达;3.分选白癜风患者外周血初始T细胞、CD8+T细胞患者外周血单个核细胞提取方法同步骤1。采用CD3、CD4、CD45RA抗体分选CD3+CD4+CD45RA+T细胞(初始T细胞),采用CD3、CD8抗体分选CD3+CD8+T细胞(CD8+T细胞);4.将初始T细胞诱导为Treg细胞并检测将上述分选的初始T细胞接种至已经包被抗-CD3和抗-CD28抗体的孔板中,经白细胞介素IL-2(100 U/mL)和TGF-β(10 ng/ml)诱导,同时加入视黄酸(10 nM)加以促进,4天后收取细胞。并用流式细胞术鉴定CD4+CD25+FOXP3+细胞(Treg细胞)并检测其比例;5.miRNA-155转染Treg细胞使用nucleofection方法对Treg细胞进行转染。首先,将1×107个Treg细胞重悬于100 μl的电转液中。然后加入100 pmol寡聚核苷酸(包括 pre-miR-155、pre-miR-ctrl、anti-miR-155、anti-miR-ctrl),并轻轻混匀。然后轻柔的将混合物加入电转杯内,并将电转杯置于电转仪上。随即使用X-01程序进行电转。电转完成后将电转杯中的细胞移入12孔板内,然后加入1.5 mLT细胞电转培养基,并置于37℃ 5%CO2的培养箱内培养。转染24小时后qRT-PCR检测细胞miRNA-155的转录水平;6.检测miRNA-155对Treg细胞分化和功能的影响上述转染培养3天后,首先采用流式细胞术检测各组Treg细胞比例;qRT-PCR、Western blot检测Foxp3表达水平;qRT-PCR、ELISA检测IL-10、TGF-β1表达水平;7.白癜风患者黑素细胞的培养及鉴定在稳定期白癜风患者远离皮损区的腹部正常皮肤处,采用BY-ⅡGM表皮移植白癜风治疗仪负压吸疱的方式,选取4片表皮,提取表皮黑素细胞,然后加入黑素细胞Hu 16选择性培养基,轻轻吹打成细胞悬液,将黑素细胞浓度调整为5×105/mL,再接种于细胞培养瓶中,置37℃,5%CO2培养箱内培养。为去除角质形成细胞和成纤维细胞,在培养的第3天,加入基因素,然后每隔1天细胞换液1次,并采用多巴染色来鉴定黑素细胞;8.实验分组共分7组A:黑素细胞对照组;B:黑素细胞+CD8+T细胞组;C:黑素细胞+Treg细胞组;D:黑素细胞+Treg 细胞+anti-miR-ctrl+CD8+T 细胞组;E:黑素细胞+Treg 细胞+miRNA-155 拮抗剂(anti-miR-155)+CD8+T 细胞组;F:黑素细胞+Treg细胞+pre-miR-ctrl+CD8+T细胞组;G:黑素细胞+Treg 细胞+miRNA-155 激动剂(pre-miR-155)+CD8+T 细胞组;首先在6孔板内加入培养至第4代的白癜风患者黑素细胞,其浓度为每孔1×105个细胞,放入培养箱培养4 h,使细胞贴壁,然后以1:5:5的比例分别接种CD8+T细胞和各组转染后的Treg细胞;9.检测miRNA-155调节Treg细胞后对CD8+T细胞的活化和凋亡的影响按照上述分组,培养3天,采用流式细胞术检测各组CD4-CD8+细胞比例,以及CD4-CD8+细胞中CD69、CD137的表达情况(CD4-CD8+细胞表面活化指标),同时采用Annexin V-FITC/PI双标记染色后,流式检测CD4-CD8+细胞凋亡情况;10.检测miRNA-155调节Treg细胞后对白癜风黑素细胞凋亡的影响实验分组转染培养3天,弃去上清液及悬浮淋巴细胞,收集黑素细胞,采用Annexin V-FITC/PI双标记染色后,流式检测黑素细胞凋亡情况。结果1.流式细胞术结果显示分选出的白癜风患者和健康人的CD3+T细胞的纯度均高于99%;分选的CD3+CD4+CD45RA+T细胞的纯度高于99%;分选的CD3+CD8+T细胞的纯度为95.32%。CD3+CD4+CD45RA+T细胞诱导后CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞的纯度为 93.15%;2.qRT-PCR结果显示,与健康组对比,白癜风患者外周血T细胞miRNA-155的表达水平显著下调(p<0.01);3.miRNA-155转染Treg细胞后,采用qRT-PCR检测各组细胞miRNA-155转录水平,miR-155激动剂组(pre-miR-155组)显著高于对照组(pre-miR-ctrl组),而miR-155拮抗剂组(anti-miR-155组)则显著低于对照组(anti-miR-ctrl组),表明miRNA-155转染成功;4.使用流式细胞术进一步检测了 miR-155对Treg细胞分化的影响,结果显示anti-miR-155引起Treg细胞百分比显著降低,而pre-miR-155组则相反,Treg细胞百分比显著升高(p<0.05)。同时采用qRT-PCR及Western blot检测Treg细胞Foxp3的转录水平和蛋白表达水平,结果显示pre-miR-155显著上调Foxp3的转录水平和蛋白表达水平,而anti-miR-155则显著下调Foxp3转录水平和蛋白表达水平,差异有统计学意义(p<0.05)。表明miR-155能够正向调节Treg细胞分化;5.采用qRT-PCR及ELISA检测IL-10和TGF-β1的mRNA转录水平和细胞外分泌水平以研究miR-155对Treg细胞功能的影响,结果表明,pre-miR-155组IL-10和TGF-β1转录水平显著升高,而anti-miR-155显著下调了这些细胞因子的转录水平。同样的,IL-10和TGF-β1的细胞外分泌水平在pre-miR-155组中上调,在anti-miR-155组中下调,差异有统计学意义(p<0.05)。表明miR-155能够正向调节Treg细胞功能;6.分组实验后,流式细胞术分选结果显示pre-miR-155组CD8+T细胞的百分比较对照组显著降低,而anti-miR-155组则相反,具有显著性差异(p<0.01)。CD69和CD137在CD8+T细胞的表达结果显示CD69在不同组的表达水平没有显著差异,而pre-miR-155处理后则显著下调了 CD137的表达水平(p<0.05)。表明miR-155调节Treg细胞后降低了CD8+T细胞晚期活化的比例;7.采用流式细胞术检测CD8+T细胞的凋亡结果显示:Treg细胞诱导CD8+T细胞凋亡的作用,通过pre-miR-155的处理则进一步增强,CD8+T细胞的凋亡显著增加(p<0.01),而anti-miR-155表现出相反的效果。表明miR-155调节Treg后促进了 CD8+T细胞的凋亡;8.实验分组共培养后,流式细胞结果显示CD8+T细胞可诱导黑素细胞凋亡,其部分可被Treg细胞的功能逆转。此外,应用pre-miR-155显著抑制了 CD8+T细胞诱导的黑素细胞凋亡(p<0.01)。结论1.白癜风患者外周血T细胞miRNA-155的表达水平显著下调;2.miRNA-155转染Treg后可正向调节Treg细胞的分化,上调Treg的标志性分子Foxp3的表达,并正向调节Treg细胞的功能;3.miRNA-155可以促进Treg细胞诱导CD8+T细胞凋亡的作用,降低了CD8+T细胞晚期活化比例;4.Treg细胞可以逆转CD8+T细胞诱导的黑素细胞凋亡,miR-155可增强Treg细胞的逆转作用,实现对黑素细胞的保护作用。