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目的：本课题拟通过链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导建立糖尿病SD大鼠模型,并采用灌胃给予地龙煎剂、蚓激酶溶液、ACEI溶液的方法,观察治疗后糖尿病大鼠肾脏组织中基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9、IV型胶原蛋白表达水平的变化,探讨地龙及其粗提取物蚓激酶对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及相关作用机制；通过观察糖尿病肾病3-4期患者使用地龙针剂前后,中医瘀血症状及体征、尿微量白蛋白、血糖、胰岛素、C肽、糖化血红蛋白及相关生化指标的变化情况,评估糖尿病肾病的病情变化情况,明确地龙针剂的疗效,为人类糖尿病肾病的早期防治提供理论依据。方法：1、实验研究清洁级健康雄性SD大鼠,体重在200-230g之间,禁食16h后将STZ(临用前以0. lmol/L, pH4.2柠檬酸缓冲液溶解新鲜配置)按剂量60mg/kg体重一次性腹腔注射,于开始注射STZ后72h后取大鼠尾静脉血测血糖,凡血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病大鼠模型制作成功。将成模大鼠随机分为糖尿病组、1g／kg地龙治疗组,3g／kg地龙治疗组,蚓激酶治疗组,ACEI+地龙治疗组,ACEI治疗组,每组12只,另外选取12只正常大鼠做正常组。其中正常组和糖尿病模型组予生理盐水每日灌胃,1g／kg地龙治疗组给予地龙汤剂1g-kg-1 d-1灌胃；3g／kg地龙治疗组地龙汤剂3g-kg-1-d-1灌胃；蚓激酶治疗组给予蚓激酶60万U·kg-1·d-1灌胃,ACEI+地龙治疗组予培哚普利4mg及地龙3g-kg-1d-1灌胃,ACEI治疗组给予培哚普利4mg·g-1·d-1灌胃。共用药干预12周。蚓激酶溶解于反渗水中。灌胃的剂量根据大鼠体重每周调整。所有大鼠自由饮食和饮水。动物饲养室恒温21℃,昼夜各12小时。于灌胃0w、2w、4w、8w、12周末测血压、收集血、尿及肾组织标本,检测血肌酐、血尿素氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、甘油三酯、胆固醇、24h尿蛋白定量及肾重／体重比值：石蜡切片行HE、PAS、PASM、Masson染色和免疫组化染色,肾组织蛋白用Western-bloting法检测,观察肾组织Ⅳ-型胶原蛋白、MMP-2、MMP-9表达情况。结果用均数±标准差(x±s)表示,两组以上均数比较采用单因素方差分析,其后进行的两者之间比较应用最小极差分析。通过SPSS-13.0统计软件处理,以P<0.05为有显著性差异的标准。2、临床研究将我院2009年6月至2010年5月临床糖尿病肾病3-4期住院患者,根据纳入标准和排除标准,将入选患者随机分为2组,地龙治疗组18例、对照组25例。按照课题设计要求地龙治疗组在对照组一般治疗基础上,给予静滴地龙针剂6ml+250ml葡萄糖溶液中静滴治疗,疗程2w。观察治疗前后患者血糖、糖化血红蛋白、尿微量白蛋白、血浆蛋白、肝、肾功能、血脂、血常规等指标的变化情况。评估治疗前后的效果。结果：1、实验研究(1)12 w末,糖尿病大鼠较正常对照组大鼠肾／体比值,24h尿量、饮水量、饮食量,24h尿微量白蛋白均有显著升高(P<0.01)。糖尿病大鼠各时间点血压均较正常组大鼠降低(P<0.05), ACEI组大鼠较模型组血压降低有统计学意义(P<0.05),其中蚓激酶组、ACEI+地龙组均较模型组血压有降低趋势,但无统计学意义。单纯模型组大鼠血压与病程总体上呈递减趋势。12周末,糖尿病大鼠ALT.AST.BUN.TG.TC均较正常组大鼠升高(P<0.05),模型组与各治疗组之间差异不明显。正常、模型及治疗组之间Cr差异不明显。单纯模型组大鼠ALT.AST.Cr.BUN.TG.TC均较Ow点大鼠增高(P<0.05)。12w末,模型组大鼠蛋白尿明显高于正常组(P<0.05),各治疗组均有降低尿蛋白的作用,且与模型组相比均有统计学意义(P<0.05)。其中以ACEI组、ACEI+地龙组疗效最显著,其次为蚓激酶治疗组及3g／kg地龙组。据各时间点观察,各组大鼠于8w前尿蛋白差异不明显,模型组大鼠尿蛋白于8w是呈现增高趋势,12w时明显增高,有统计学意义(P<0.05)。(2)病理组织学改变PAS及PASM染色结果显示,与正常组大鼠相比,糖尿病组大鼠肾小球系膜基质增多,系膜扩张。蚓激酶组、1g／kg地龙组、3g／kg地龙组系膜基质增多较糖尿病组明显减轻。肾小球硬化半定量评分结果表明,与糖尿病组比较,蚓激酶治疗组,1g／kg地龙组、3g／kg地龙组能明显降低肾小球硬化指数(p<0.05)。与正常组大鼠相比,糖尿病组大鼠肾小管萎缩,扩张,空泡变性,管型形成均明显增加。肾小管损伤半定量评分结果表明,蚓激酶治疗组、1g／kg地龙组、3g／kg地龙组、ACEI+地龙组均能明显降低糖尿病大鼠肾小管损伤指数(p<0.05)。MASSON染色结果显示,与正常组大鼠相比,糖尿病组大鼠肾小球系膜区、肾小管间质胶原沉积明显增加。MASSON染色半定量结果表明,与糖尿病组比较,蚓激酶治疗组、1g／kg地龙组、3g／kg地龙组、ACEI+地龙组能明显降低肾小管间质胶原沉积(p<0.05)。(3)免疫组织化学Ⅳ型胶原蛋白的表达正常组大鼠肾小球及系膜区Ⅳ型胶原表达较少,糖尿病组大鼠肾小球系膜区Ⅳ型胶原表达明显增多,蚓激酶治疗组、1g／kg地龙组、3g／kg地龙组、ACEI+地龙组Ⅳ型胶原表达较糖尿病组减少,差异有显著性(P<0.05)。金属基质蛋白酶-2(MMP-2)的表达正常组大鼠肾小球、近端小管、远端小管、集合管MMP-2表达较多,糖尿病组大鼠肾小球、近端小管、远端小管、集合管表达MMP-2明显较少,蚓激酶治疗组、lg／kg地龙组、3g／kg地龙组、ACEI+地龙组MMP-2表达较糖尿病组增多,差异有显著性(P<0.05)。金属基质蛋白酶-9(MMP-9)的表达正常组大鼠肾小球、近端小管、远端小管、集合管MMP-9表达较多,糖尿病组大鼠肾小球、近端小管、远端小管、集合管MMP-9表达明显较少,蚓激酶治疗组、1g／kg地龙组、3g／kg地龙组、ACEI+地龙组MMP-2表达较糖尿病组增多,差异有显著性(P<0.05)。(4) Western BlotⅣ型胶原蛋白表达与正常组比较,糖尿病大鼠肾组织Ⅳ型胶原蛋白表达水平明显升高,3g／kg地龙组及蚓激酶组Ⅳ型胶原蛋白表达水平较糖尿病组明显减少,差异有显著性(P<0.05)。MMP-9蛋白表达与正常组比较,糖尿病大鼠肾组织MMP-9蛋白表达水平明显降低,3g／kg地龙组及蚓激酶组MMP-9蛋白表达水平较糖尿病组明显增加,差异有显著性(P<0.05)。2、临床研究两组治疗后瘀血证候评分、尿微量白蛋白、血脂异常均较治疗前明显改善,地龙治疗组较对照组疗效更为显著(P<0.05)。结论：1.糖尿病肾病时,金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-9表达减少,细胞外基质Ⅳ型胶原蛋白表达增多,与肾脏细胞外基质积聚、肾脏肥大及肾功能受损相一致,提示MMP-2、MMP-9,Ⅳ型胶原蛋白在糖尿病肾病的发生发展中起作用。2：地龙煎剂、蚓激酶可显著减少实验性糖尿病大鼠模型肾小球系膜区细胞外基质Ⅳ型胶原的蛋白的表达,纠正金属基质蛋白酶MMP-2、MMP-9表达的减少,促进糖尿病大鼠肾小球内细胞外基质的降解,减轻肾小球硬化和肾小管损伤,减少蛋白尿的生成。3.地龙煎剂及其粗提取物蚓激酶对糖尿病肾脏保护作用的机制可能是：提供纤溶酶源激活物(e-PA),激活纤溶酶,促进金属基质蛋白酶MMP活化,降解细胞外基质,从而改善糖尿病过程中肾小球系膜基质的沉积,基底膜增厚,通过改善细胞外基质代谢从而延缓糖尿病肾病肾小球硬化、肾小管纤维化的进展。4.地龙针剂临床观察,结果显示：地龙针剂可以通过改善糖尿病患者血瘀证候,改善血脂紊乱,降低尿微量白蛋白排泄率,从而达到治疗和预防糖尿病肾病的作用。