研究背景心力衰竭(心衰)与胰岛素抵抗之间存在密切的关系。一方面,胰岛素抵抗是心衰发生的独立危险因素;另一方面,心衰患者也较普遍存在胰岛素抵抗,且有胰岛素抵抗的心衰患者预后更差。然而,以往的这些研究主要关注的是全身胰岛素抵抗(systemic insulin resistance)与心衰的关系。我们和其他课题组近年均发现,胰岛素抵抗有器官特异性。心肌也是胰岛素作用的靶器官之一,但由于心肌只占到机体体重的0.5%,对整体血糖水平的影响不大,长期以来对心肌胰岛素敏感性问题亦未引起足够的重视。我们课题组的前期研究提示,心肌胰岛素抵抗(myocardial insulin resistance)与心血管疾病的发生、发展有着直接的关系,但心肌胰岛素抵抗在心衰过程中所起的作用及其机制目前尚不清楚。研究目的1.明确心肌梗死后心肌胰岛素敏感性是否发生变化,心肌缺血后是否会发生心肌胰岛素抵抗?2.若存在心肌胰岛素抵抗,探讨其发生的主要机制及其与缺血后心衰发生发展的关系。实验方法大鼠冠脉左前降支结扎造缺血性心衰模型。在心梗手术前和心梗1 wk、2 wk、4wk和8 wk后,对大鼠行超声心动图检测,检测心脏结构和收缩功能。测定空腹血糖和血清胰岛素水平,行葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验评价大鼠全身胰岛素敏感性。应用小动物PET/CT测定胰岛素刺激下心肌对氟脱氧葡萄糖(FDG)的最大标准摄取值(SUVmax,standardized uptake value)评价心肌胰岛素敏感性,Western blot方法分析在不同情况下心肌胰岛素信号分子的变化。以酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)测定心肌与血清TNF-α的水平。应用过表达TNF-α的腺病毒间接经冠脉转染正常大鼠心肌,以表达GFP的腺病毒作为对照,观察TNF-α在心肌过表达能否直接引起心肌胰岛素抵抗。另一方面,在心肌缺血前两天开始给予大鼠腹腔注射TNF-α拮抗剂依那西普(Etanercept)300μg/250 g体重,然后在缺血1 wk内每两天腹腔注射相同剂量依那西普,观察拮抗TNF-α对心肌胰岛素敏感性的影响。参照前期相关研究,在缺血1 wk内给予大鼠胰岛素治疗,观察其对心肌胰岛素敏感性和心衰进程的影响。委托南京大学模式动物研究所构建胰岛素受体(Insr)基因基于Cre-Lox P条件性敲除小鼠Insrfl/fl,与肌球蛋白重链α(α-MHC)调控的他莫昔芬诱导Cre表达的小鼠(α-MHC-Mer Cre Mer)杂交后得到α-MHC-Mer Cre Mer/Insrfl/fl小鼠。选用8-10周龄的α-MHC-Mer Cre Mer/Insrfl/fl雄性小鼠给予腹腔注射他莫昔芬50 mg/kg,连续3天,以诱导心肌特异性Cre的表达,敲除心肌胰岛素受体基因,得到他莫昔芬诱导的心肌特异性胰岛素受体敲除小鼠(tamoxifen-induced cardiomyocyte-specific insulin receptor knockout,TCIRKO)。行葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验评价小鼠的全身胰岛素敏感性。缺血前和缺血4 wk后,对心肌特异性胰岛素受体敲除小鼠和对照小鼠用超声心动图检测心脏结构和功能变化。实验结果1.心肌缺血后心功能进行性降低,室腔逐渐扩大。手术前,假手术(Sham)组和心肌缺血(MI)组的EF、LVESD和LVEDD值无明显差异。心肌缺血1 wk时,MI组的射血分数(EF)从手术前的71.6±1.9%下降到53.1±3.4%(P<0.001),左室收缩末期内径(LVESD)从0.22±0.03 cm增加到0.45±0.03 cm(P<0.001),左室舒张末期内径(LVEDD)从0.51±0.02 cm增加到0.65±0.03 cm(P<0.001)。在心肌缺血4 wk时,MI组的EF下降到40.1±3.1%,LVESD增加到0.62±0.03cm,LVEDD增加到0.75±0.03 cm,其中EF和LVESD与心肌缺血1 wk时相比均有明显差异(P<0.05和P<0.01)。在心肌缺血8 wk时,MI组的EF值为38.2±4.3%,LVESD与LVEDD分别为0.63±0.03 cm、0.78±0.03 cm,与心肌缺血4 wk时相比无明显差异。2.心肌缺血1 wk时,心肌发生胰岛素抵抗,而全身胰岛素敏感性无明显变化。与基础状态(未予胰岛素刺激)相比,胰岛素可明显增加Sham组大鼠心肌FDG摄取(SUVmax 5.1±0.5 vs.0.9±0.2 g/ml,n=6,P<0.001)。与Sham组大鼠相比,心肌缺血30 min时胰岛素刺激下的心肌FDG摄取值更高(SUVmax 9.5±0.8 vs.5.1±0.5 g/ml,n=6,P<0.001),但在此之后(缺血1 d到2 wk)胰岛素刺激下的心肌FDG摄取逐渐降低。与Sham组相比,心肌缺血1 wk与2 wk时胰岛素刺激下的心肌FDG摄取均明显降低(SUVmax MI 1 wk 2.7±0.4 vs.5.1±0.5 g/ml;MI 2 wk 2.1±0.5 vs.5.1±0.5 g/ml,n=6,均P<0.01),而在心肌缺血1 d、1 wk和2 wk时,空腹血糖(FPG)、血清胰岛素水平(FIN)、定量胰岛素敏感性检测指数(Quantitative insulin sensitivity check index,QUICKI)与Sham组相比均无明显差异,口服葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验的结果也无明显差异,表明心衰早期有心肌胰岛素抵抗的发生,但并无全身胰岛素敏感性的明显变化。3.心肌缺血1 wk时,心肌的胰岛素信号通路出现选择性转导障碍。与基础状态相比,胰岛素刺激可明显增加Sham组心肌Akt的磷酸化和GLUT4的膜转位,轻度增加ERK 1/2的磷酸化,而对p38 MAPK的磷酸化无明显影响。在心肌缺血1d时,胰岛素刺激仍可增加心肌Akt和ERK 1/2的磷酸化,增加GLUT4的膜转位,减少p38 MAPK的磷酸化。但在心肌缺血1 wk时,与基础状态相比,胰岛素刺激增加心肌Akt磷酸化和GLUT4膜转位的效应明显降低,而明显增加心肌p38 MAPK的磷酸化。上述结果表明,正常情况下胰岛素可激活Akt和ERK 1/2,但在心肌缺血1 wk时,胰岛素激活Akt和ERK 1/2受阻,而明显激活p38 MAPK,即出现胰岛素信号通路的选择性转导障碍。4.正常心肌过表达TNF-α直接引起心肌胰岛素抵抗。与转染过表达GFP腺病毒的对照组相比,转染过表达TNF-α腺病毒的大鼠心肌中TNF-α的水平明显升高,但血清中的TNF-α未能测出(低于ELISA试剂盒的测定下限10 pg/ml)。在GFP腺病毒转染心肌1 wk时,胰岛素刺激可明显增加心肌FDG摄取,Akt磷酸化和GLUT4转位。然而,在TNF-α腺病毒转染心肌1 wk时,胰岛素的上述效应明显被抑制,与此同时,TNF-α腺病毒转染心肌的p38 MPAK的磷酸化明显增加。5.心肌过表达TNF-α加重缺血后的心脏功能障碍和心室扩张。GFP腺病毒和TNF-α腺病毒转染前大鼠的心脏射血分数与室腔内径无明显差异。行腺病毒转染的同时,结扎大鼠冠状动脉左前降支造心肌缺血模型。在心肌缺血1 wk时,与GFP腺病毒转染心肌相比,TNF-α腺病毒转染的心脏射血分数更低(EF 41.3±4.2 vs.55.2±3.4%,n=6,P<0.05),室腔内径更大(LVESD 0.63±0.04 vs.0.52±0.03 cm,n=6,P<0.05)。在缺血4 wk时,GFP腺病毒和TNF-α腺病毒转染大鼠的心脏射血分数与室腔内径无明显差异。6.给予依那西普降低心肌TNF-α水平,可部分恢复心肌的胰岛素敏感性,但未能改善缺血后心脏的功能和心室重构。大鼠心肌缺血1 d和1 wk后心肌TNF-α水平明显升高,而血清TNF-α水平未能测出,依那西普干预后心肌TNF-α水平明显降低。在心肌缺血1 wk时,胰岛素刺激下FDG摄取、Akt磷酸化和GLUT4转位均明显降低,而给予依那西普可部分恢复了胰岛素的上述效应,下调p38MAPK的磷酸化水平。大鼠缺血4 wk时,生理盐水处理组大鼠与依那西普处理组大鼠心脏的射血分数与左室收缩末期内径均无明显差异(EF 43.0±2.7%vs.40.1±3.1%,LVESD 0.60±0.03 cm vs.0.62±0.03 cm,n=6,P>0.1)。7.缺血早期胰岛素干预可改善缺血后心肌胰岛素敏感性和心脏功能,抑制左室扩张。缺血后早期胰岛素干预(心肌缺血30 min后从尾静脉泵注50 U/L胰岛素2.5h,泵注速率4 ml/kg/h,然后在缺血1 wk内每天给大鼠皮下注射胰岛素0.5 U/kg BW)可明显降低缺血1 d和1 wk后非梗死区心肌的TNF-α含量,改善心肌缺血1 wk时胰岛素刺激的FDG摄取。与生理盐水对照组相比,早期胰岛素干预组的心脏功能(EF,54.3±4.1%vs.40.1±3.1%,n=6,P<0.05)明显增加,左室收缩末期内径明显降低(图6F,LVESD,0.48±0.04 cm vs.0.62±0.03 cm,n=6,P<0.05)。8.心肌特异性胰岛素受体敲除加重小鼠缺血后心脏功能障碍和室腔扩张。Western blot的结果显示,TCIRKO小鼠表现为心肌特异性的胰岛素受体敲除(骨骼肌和肝脏的胰岛素受体表达正常)。基础状态下,TCIRKO小鼠与对照小鼠心脏的心脏功能和室腔内径相比无明显差异,但在心肌缺血4 wk后,与对照小鼠相比,TCIRKO小鼠的射血分数更低(EF 31.5±2.4%vs.45.2±2.7%,n=6,P<0.05),左室收缩末期容积更大(LVESV 56.0±5.3μl vs.35.4±3.5μl,n=6,P<0.05)。结论1.缺血性心衰早期(1 wk)即出现心肌胰岛素抵抗,且独立于全身胰岛素抵抗而存在;2.心肌梗死所致心肌局部TNF-α大量产生是缺血后心肌胰岛素抵抗的发生机制之一;3.缺血早期给予胰岛素对缺血心脏具有保护作用,可延缓心衰的发生,而胰岛素信号障碍可加速缺血性心衰的发生发展。上述结果提示心肌胰岛素信号在缺血心脏保护及延缓心衰发生发展中具有重要作用。