目的： 1.研究BN大鼠作为动物致敏模型的可行性，并以此初步建立致敏动物模型和评价指标，为食品的致敏性评价提供手段和方法。 2.研究不同蛋白质在体外模拟胃肠消化环境和热加工处理环境中的稳定性，以确定模拟胃肠液消化稳定性试验和热稳定性试验中的阳性和阴性参考蛋白质，并以此建立体外蛋白消化稳定性和热稳定性方法。 3.通过原核表达系统提取和纯化足量的胡桃Jug r 1蛋白，为其致敏性评价做好准备。 4.通过体内体外实验模型对Jug r1蛋白的致敏性进行初步的研究。 方法： 1.B N大鼠致敏动物模型的实验研究经口致敏模型：将30只雌性BN大鼠随机分成3组——OVA组、PAP组和阴性对照组，每组10只，分别灌胃给予1mg/ml的OVA、PAP和生理盐水，每只每天1 ml，共进行42天。腹腔注射致敏模型：40只雌性BN大鼠随机分成4组——OVA组、OVA+Al(OH)<,3>组、PAP组和阴性对照组，每组10只，第1天分别腹腔注射0.1mg/ml的OVA、OVA+免疫佐剂Al(OH)<,3>、PAP和生理盐水1ml，第5和10天重复两次。 各组大鼠于第14、28、42天内眦取血离心分离血清用以检测特异性IgG和IgE抗体，第21、35天内眦取血加入抗凝剂离心分离血浆以检测组胺，以之观察免疫系统效应。各组大鼠42天试验结束后随机抽取5只大鼠予以大剂量(2ml5mg/ml)相应物质的刺激，监测7小时内血压变化以观察循环系统效应。各组剩余的5只大鼠经口予以2ml 50mg/ml的相应物质的刺激，30分钟后灌胃给予100mg/ml的β-LG 1ml，分别于0.5、1、2、4和8小时后内眦取血，离心分离血清，检测血清中的β-LG以观察胃肠系统渗透性的改变。 2.体外模拟消化稳定性和热稳定性模型研究按照美国药典提供的模拟胃液、肠液配方，建立体外模拟胃肠消化体系，并模拟热加工处理环境，选取常见食物致敏原蛋白(鸡卵清蛋白、牛β-乳球蛋白)、不常见食物致敏原蛋白(牛血清白蛋白)和无致敏史食物蛋白(大豆脂肪水解酶、马铃薯酸性磷酸酶)，研究这5种已知致敏性的标准蛋白的消化和热稳定性，选出该模型的阳性和阴性对照，用以评价其它蛋白质的稳定性。 3.胡桃蛋白Jug r1的原核表达与纯化对已建立的工程菌进行质粒测序确认构建正确后，进行诱导表达最佳条件的探索。大量诱导表达Jug r 1蛋白包涵体，通过超声破碎菌体分离并纯化包涵体。将包涵体溶于6M盐酸胍的包涵体溶解液中，并通过透析方法使其复性，得到Jugr1蛋白溶液。使用考马斯亮兰G250法测定蛋白含量，最后用低温真空离心浓缩干燥机浓缩溶液。 4.Jug r1的致敏性研究体内试验：选用腹腔注射致敏模型，30只雌性BN大鼠随机分成3组：OVA组、Jug r 1组和PAP组。第1天经腹腔注射途径给予1ml 0.1mg/ml相应的蛋白溶液，第5和10天重复两次。第14、28、42天取血清检测特异性IgE抗体，第21、35天取血浆检测组胺含量。第42天后监测血压和进行肠渗透性检测。 体外试验：对Jug r1进行模拟胃液消化稳定性和热稳定性试验，设OVA为常见致敏原对照、BSA为不常见致敏原对照、PAP为非致敏原对照；进行模拟肠液消化稳定性试验，设OVA为常见致敏原对照、BSA为不常见致敏原对照、LPE为非致敏原对照。 结果： 1.B N大鼠致敏动物模型的实验研究经口致敏模型：特异性抗体ELISA结果显示第14、28、42天OVA均激发较高的特异性IgG抗体，平均log<,2>IgG滴度分别为10.5、12.3、12；PAP激发的特异性IgG抗体滴度则较低，平均log<,2>IgG滴度分别为4、4.3、3.3；OVA激发一定程度的特异性IgE抗体，平均log<,2>IgE滴度分别为2、3.1、2.6，；而PAP未能激发特异性IgE抗体。PCA试验结果显示第14、28、42天OVA激发特异性IgE抗体滴度分别为1：2、1：4、1：2，PAP未能激发特异性IgE抗体。组胺测定结果第21天OVA组大鼠血浆中组胺含量较阴性对照组升高，有统计学差异(p<0.05)，OVA组第35天和PAP组血浆中组胺含量较阴性对照组无统计学差异(p>0.05)。血压和肠渗透性均未测得有所改变。腹腔注射致敏模型：OVA+A1(OH)<,3>组有一只大鼠血压出现暂时性下降，很快恢复正常。特异性抗体ELISA结果显示第14、28、42天OVA激发较高的特异性IgG抗体，平均log<,2>IgG滴度分别为14.8、16.7、17；OVA+A1(OH)<,3>激发较高的特异性IgG抗体，平均log<,2>IgG滴度分别为17.6、16.1、17.7；PAP激发的特异性IgG抗体滴度则较低，平均log<,2>IgG滴度分别为4.6、5、3.4；OVA和OVA+Al(OH)<,3>都激发较高的特异性IgE抗体，OVA组平均log<,2>IgE滴度分别为4.3、5.1、3.8，OVA+A1(OH)<,3>组平均log<,2>IgE滴度分别为6、7.4、5.6；而PAP未能激发特异性IgE抗体。PCA试验结果显示第14、28、42天OVA激发特异性IgE抗体滴度分别为1：8、1：16、1：4，OVA+Al(OH)<,3>激发特异性IgE抗体滴度分别为1：16、1：64、1：16，PAP未能激发特异性IgE抗体。组胺测定结果第21、35天OVA和OVA+Al(OH)<,3>组大鼠血浆中组胺含量较阴性对照组升高，有统计学差异(p<0.05)，PAP组血浆中组胺含量较阴性对照组无统计学差异(p>0.05)。肠渗透性检测结果显示OVA组有一只大鼠在0.5小时血清中测得β-LG，OVA+Al(OH)<,3>组有一只大鼠在0.5和l小时血清中都测得β-LG，一只大鼠在0.5小时血清中测得β-LG。 2.体外模拟消化稳定性和热稳定性模型研究OVA在模拟胃肠液中60min不降解稳定存在，可作为模拟胃肠液消化稳定性的阳性对照；但β-LG在模拟肠液中30min内完全降解，因此不可作为模拟肠液消化稳定性阳性对照；BSA在模拟胃液中30min内完全降解，在模拟肠液中60min部分降解，可用作不常见致敏原蛋白对照；PAP在模拟胃液中15s即完全降解，LPE在30s内完全降解，都可作为模拟胃液消化稳定性的阴性对照；而在模拟肠液中PAP 60min完全不降解，LPE 60min大部分降解，因此在模拟肠液消化稳定性试验中应选LPE为阴性对照。在热稳定性试验中，OVA、β-LG、BSA60min内不降解，都可作阳性对照，PAP 60min内完全降解，可作为阴性对照。 3.胡桃蛋白Jug r 1的原核表达与纯化工程菌进行质粒测序结果显示克隆构建成功。表达蛋白的可溶性分析标明目的蛋白以不溶的包涵体形式存在。优化诱导表达条件发现IPTG 0.1mM诱导4小时时，Jug r 1蛋白表达量最高。大量表达、分离和纯化后将包涵体溶于6M盐酸胍的包涵体溶解液中，并通过透析方法使其复性得到Jug r 1蛋白溶液，考马斯亮兰G250法测定蛋白含量为393.9μg/ml，使用低温真空离心浓缩干燥机浓缩溶液，得到终浓度为10mg/ml的Jug r1溶液。重复此过程得到约60ml的10mg/ml的Jug r 1溶液。 4.Jug r 1的致敏性研究体内试验结果显示施以受试蛋白Jug r 1处理的大鼠并未出现异常血压，只激发了很低的特异性IgE抗体滴度(第28天时最高，仅为1：2)，组胺较阴性对照组无统计学差异，肠渗透性亦未测得改变。 结论： 1.本研究通过经口和腹腔注射两种常见致敏途径，以常见致敏食物蛋白质OVA、无致敏史的食物蛋白质PAP给予BN大鼠，并选取有代表性的循环系统指标(血压)、免疫指标(特异性IgE抗体、组胺)和胃肠系统指标(肠渗透性)作为判断终点，发现OVA可激发BN大鼠的过敏反应，而PAP则不能。本研究认为BN大鼠致敏动物模型是评价食品致敏性较适合的动物模型，OVA和PAP可分别作为模型的阳性和阴性对照蛋白，血压、特异性IgE(ELISA法)和组胺以及肠渗透性(ELISA法)作为评价指标，并且致敏模型的应用中不宜使用免疫佐剂。据此初步建立了致敏动物模型，为研究后期和将来的食物致敏性研究打下了基础，并提供了可靠的技术手段。 2.体外模拟胃肠消化环境、热加工处理环境，研究了不同致敏性的标准蛋白的消化和热稳定性，确定适宜用于体外模拟消化稳定性和热稳定性试验的参照蛋白：模拟胃液消化稳定性和热稳定性试验中设OVA为常见致敏原对照、BSA为不常见致敏原对照、PAP为非致敏原对照，模拟肠液消化稳定性试验中设OVA为常见致敏原对照、BSA为不常见致敏原对照、LPE为非致敏原对照。建立了体外模拟消化稳定性和热稳定性模型，为评价其他蛋白质是否具有致敏原蛋白特征提供了依据和手段。 3.通过大肠杆菌原核表达胡桃蛋白质Jug r 1。对诱导表达条件、纯化方法、蛋白质变性复性条件的尝试和摸索，最终得到纯度较高的Jug r 1蛋白质溶液，为后期Jug r1致敏性研究做好了准备。 4．利用前期建立的体内和体外模型，对原核表达的Jug r1的致敏性进行了一定的研究。体内试验该蛋白并未显示出致敏性，而体外试验结果却提示该蛋白具有致敏原的特征(与牛血清白蛋白相似)，体内外试验结果的差异可能与BN大鼠的敏感性和蛋白质自身的性质有关。因此Jug r1的致敏性尚需进一步研究。