利用体外培养细胞系评价外源蛋白安全性的研究

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qunli19890523
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随着转基因技术的日趋成熟,已经能够将外源基因准确的导入到各种动植物体进行重组表达,获得人们想要的性状。该插入的特定的外源基因,要么是一种调控序列,要么编码一种蛋白质,许多转基因作物是通过外源基因表达的特定蛋白质实现人们的期望的。在转基因作物进入市场之前,需要彻底评价它们的安全性。目前,没有一个统一确定的实验用于预测外源蛋白质的安全性。相比于在体模型的复杂性,利用体外细胞培养系统初步评价安全性具有许多优点,如低成本、速度快、减少动物的使用,并且能获得很好的效果,能够研究诱导细胞的毒性机制,从建立的细胞系获得的结果可重复性好。这些优点使体外模型受到广泛的研究。  方法:选择蓖麻子蛋白代替外源蛋白,用其处理人外周血B淋巴细胞,蓖麻子蛋白浓度范围0~100 ng/mL,在6 h、12 h用CCK-8试剂检测细胞的相对增殖率,研究对细胞的剂量-时间效应,并且确定其12 h的半数抑制浓度。添加接近半数抑制浓度蓖麻子蛋白20 ng/mL处理细胞,在2 h、6 h、10 h、12 h时间段检测TNF-α、CD40、IL-1β及Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表达情况,通过检测免疫相关基因及凋亡相关基因的表达情况,研究用基因表达变化评价外源蛋白安全可行性;采用彗星实验,分析试验组和对照组遗传毒性方面的差异;用 AO/EB双荧光染色法和流式细胞术检测两组间细胞凋亡情况。根据实验情况,得出评价结论。  结果和结论:与对照组相比,在6 h诱导时间内,试验组细胞毒性在较低剂量(10~40 ng/mL)会提高细胞相对活力,40 ng/mL以上表现抑制作用。12 h结果为随着浓度的增高,细胞相对活力越来越低,毒性作用越来越明显,表明毒性作用呈现一定的剂量-时间效应。基因表达的结果显示,试验组TNF-α、CD40基因表达显著升高。使用彗星实验检测遗传毒性,试验组尾部DNA百分比、OTM显著增高,两组结果差异显著。在检测凋亡实验中,试验组凋亡率随着浓度和时间的增加而升高。故可以通过使用IM-9细胞系检测细胞相对增殖率、TNF-α和CD40基因表达变化、彗星实验、检测凋亡等方法综合评价蛋白质安全性。
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