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当今,心脑血管性脑血栓疾病对人类健康和生命的威胁日益严重,探寻和研发治疗抗血栓的药物已经成为各国医疗界的研究热点。近几年来,虽然抑制血小板活性和溶解血栓的药物有所发展,但是这些药物存在一定的不足如副作用多、疗效不显著、周期长等。因此研发出更适合临床应用的抗凝溶栓药物,仍需不断探索和研究。蚊子是多种疾病的传播媒介如登革热、乙型脑炎、黄热病、丝虫病和疟疾等,主要分布于东南亚地区及我国南方大部。当蚊子吸血时唾液便分泌抗凝血物质,这些抗凝血物质不仅可以干扰宿主的免疫反应、凝血反应和炎症反应以便帮助吸血的顺利完成,同时也是一组潜在药理活性的物质。在哺乳动物中,抗凝血酶主要是由肝细胞分泌,是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族重要成员之一,其对维持凝血和抗凝血之间的动态平衡具有重要意义。随着分子生物学与基因工程技术的迅猛发展,若能实现在蚊虫体内提取安全、有效的蛋白酶抑制剂并用于预防、诊断和治疗血栓性疾病,必将为人类抗凝溶栓药物的研发提供重要的参考依据。为探索蚊虫体内抗凝血物质对血栓性疾病的治疗的可行性,本研究成功克隆出白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174基因和AL-71基因,并进行AL-71基因的原核表达,为蚊虫抗凝血物质的进一步研究奠定了基础。具体研究结果如下：本试验成功克隆白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174基因,经测序分析发现,序列大小为1383bp。经同源性分析,获得的AL-174基因片段与GenBank中已发表的AL-174核苷酸序列同源性可达84.26%,氨基酸序列同源性达82.57%,说明AL-174基因序列在蚊种间具有一定的保守性。从系统发生树上的位置关系可知：白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174核苷酸序列位于系统发生树主干支上,说明该基因与其它蚊种亲缘关系较远。利用生物学分析软件对AL-174蛋白一级、二级结构进行预测和三级结构同源建模。结果显示,AL-174蛋白结构中包含大量二硫键,α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲,分子内6个半胱氨酸以1-6、2-4、3-5的连接方式形成三对二硫键,活性部位均含有保守的组氨酸、丝氨酸和精氨酸,催化结构域的多序列比对表现出较高的相似性,并且催化位点的氨基酸残基与丝氨酸蛋白酶抑制剂原基因序列基本一致。本试验成功克隆白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-71基因,经测序分析发现,序列大小为1362bp。经同源性分析,获得的AL-71基因片段与已发表AL-71基因序列同源性达88.85%,氨基酸序列同源性达90.24%,说明该基因序列在蚊种间具有一定的保守性。系统进化分析表明,白纹伊蚊丝氨酸抗凝AL-71基因序列、原白纹伊蚊丝氨酸抗凝AL-71基因序列和白纹伊蚊丝氨酸抗凝血AL-174基因序列位于系统发生树同一分支上,说明亲缘关系较近。利用生物学分析软件对AL-71蛋白一级、二级结构进行预测和三级结构同源建模,结果显示,AL-71蛋白结构中同样包含大量的二硫键,α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲,催化结构域的多序列比对表现出较高的相似性,并且催化位点的氨基酸残基与丝氨酸蛋白酶抑制剂原基因序列基本一致。本试验成功构建原核表达载体PET-AL-71,并转化到表达稀有碱基Rosetta (DE3)表达菌株中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,获得了分子量大小约为50KD的AL-71蛋白,IPTG终浓度为37℃诱导5h时蛋白的表达量较高。