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犬新孢子虫(Neospora caninum),简称新孢子虫,是一种寄生于细胞内的原虫,其能够引起中间宿主牛、羊等动物生殖障碍等疾病和终末宿主犬及犬科动物神经系统紊乱等疾病。新孢子虫感染呈世界性流行,每年给世界养牛业造成严重的经济损失。目前为止,市面上没有预防和治疗新孢子虫病的商品化疫苗和特效药,主要原因是人们对宿主与新孢子虫感染之间的免疫机制仍不清楚。近年来在宿主与新孢子虫感染之间的先天免疫机制研究上取得一定的成果。先天免疫系统通过宿主细胞表达的模式识别受体(PRR)识别入侵微生物的病原相关分子模式(PAMP),随后介导机体发生先天免疫防御反应,如通过炎性反应释放细胞因子和趋化因子等过程对入侵的病原快速识别和清除。本实验室前期研究发现新孢子虫感染腹腔巨噬细胞显著上调NOD样受体中NLRP3基因,并激活NLRP3炎症小体来发挥抗新孢子虫的作用。NLRP3炎症小体激活能够分泌细胞因子IL-1β和IL-18,并介导其释放到细胞外以发挥下游的免疫效应,但新孢子虫感染是如何诱导腹腔巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化并不清楚。新孢子虫感染犬中性粒细胞能够诱导活性氧(ROS)依赖的胞外陷阱产生,因此我们猜想新孢子虫、ROS和NLRP3炎症小体之间是否存在联系,本研究探讨了新孢子虫感染对腹腔巨噬细胞ROS释放的影响,并通过干预ROS来研究其对NLRP3炎症小体活化及虫体增殖的影响,以阐明新孢子虫感染诱导的ROS对NLRP3炎症小体活化和虫体增殖的调控,从而以ROS介导NLRP3通路为靶标,寻找一种新型的抗新孢子虫感染的潜在药物,为新孢子虫病的治疗提供新的思路。主要研究内容如下:新孢子虫诱导腹腔巨噬细胞中ROS升高:分离小鼠原代腹腔巨噬细胞及纯化新孢子虫建立感染模型,然后检测胞内ROS水平。通过ROS抑制剂NAC预处理和不同数量的新孢子虫感染,经荧光染料DCFH-DA标记细胞内ROS。结果发现新孢子虫感染腹腔巨噬细胞后显著上调胞内ROS的释放,并与虫体感染数量呈正相关。ROS调控NLRP3炎症小体和巨噬细胞中新孢子虫增殖:首先经ROS抑制剂NAC预处理感染新孢子虫的巨噬细胞,通过检测IL-1β释放、NLRP3表达、细胞死亡释放的LDH和胞内荷虫量评估ROS对NLRP3炎症小体和胞内虫体增殖的影响。然后检测ROS诱导剂Pyrogallol(PG)和Piperlongumine(PL)对细胞中ROS释放和IL-1β分泌的调控,从中找到激活NLRP3炎症小体的ROS诱导剂PG。随后,进一步研究ROS诱导剂PG介导的NLRP3炎症小体对胞内虫体的调控。结果发现ROS抑制剂NAC降低LDH,IL-1β和NLRP3的产生,但增加细胞内荷虫量;通过ROS抑制剂NAC可得知新孢子虫诱导ROS调控NLRP3炎症小体和胞内虫体的增殖。在新孢子虫感染腹腔巨噬细胞中,ROS诱导剂PL随浓度升高反而抑制细胞ROS产生和IL-1β分泌。但是ROS诱导剂PG能够随剂量促进ROS和IL-1β的释放,并发现30μM PG对IL-1β、caspase-1、NLRP3表达和LDH的释放的促进最显著,同时细胞荷虫量显著降低,由此得到PG诱导ROS产生来调控腹腔巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化和抑制胞内新孢子虫增殖。NLRP3调控ROS介导的炎症小体及虫体增殖:通过ROS抑制剂NAC、ROS诱导剂PG和NADPH Oxidase抑制剂Diphenyleneiodonium chloride(DPI)分别处理WT和Nlrp3-/-巨噬细胞,检测其对WT和Nlrp3-/-细胞中ROS、IL-1β以及LDH的调控,再检测ROS抑制剂NAC、ROS诱导剂PG对WT和Nlrp3-/-细胞内荷虫量的影响。结果发现在WT细胞中,相比于新孢子虫感染组,抑制剂组NAC和DPI处理均降低ROS、IL-1β和LDH的释放,但诱导剂PG处理促进ROS、IL-1β和LDH的释放。而在Nlrp3-/-细胞中,DPI、NAC和PG在调控ROS释放的趋势同WT细胞时,却均未影响IL-1β分泌,表明新孢子虫可通过诱导NADPH依赖性ROS激活NLRP3炎症小体。在WT细胞中,NAC增加胞内荷虫量,PG降低胞内荷虫量;而在Nlrp3-/-细胞中,NAC处理也未改变胞内荷虫量,PG处理轻微降低胞内荷虫量,但仍显著高于PG处理的WT型组。因此表明NLRP3参与调控ROS介导的炎症小体和胞内虫体增殖,并且PG通过诱导ROS调控NLRP3炎症小体活化来发挥较好的抗新孢子虫作用。ROS诱导剂PG介导NLRP3炎症小体在宿主体内抗新孢子虫作用:建立新孢子虫感染WT和Nlrp3-/-小鼠模型,感染两天后向小鼠腹腔注射PG,对血清中IL-18和腹腔灌洗液细胞中荷虫量进行检测;进一步研究PG治疗新孢子虫感染的效果,将PG作用于WT小鼠,对小鼠体重、存活率、组织荷虫量及病理变化进行检测。结果发现在WT组中,PG显著上调血清中IL-18和降低腹腔灌洗液细胞中荷虫量;而在Nlrp3-/-组中,与仅感染组相比,PG处理未导致IL-18升高,腹腔灌洗细胞中荷虫量仅轻微降低,但仍显著高于PG处理的WT组。在进一步的动物试验中发现PG可显著降低新孢子虫感染引起的体重丢失,提高小鼠生存率,减少心、肝、脾、肺、肾和脑组织中的荷虫量和病理损伤。以上结果表明PG诱导宿主NLRP3炎症小体的活化来发挥抗新孢子虫作用,ROS-NLRP3通路能够成为寻找治疗新孢子虫病的药物靶标。综上所述,新孢子虫诱导的ROS在NLRP3炎症小体活化和控制寄生虫中起重要作用,并且ROS诱导剂PG介导NLRP3炎症小体活化来控制宿主内外新孢子虫感染,ROS-NLRP3通路能够成为寻找治疗新孢子虫病的潜在药物靶标。