猪繁殖与呼吸综合征严重危害着世界养猪业的健康发展。每年用于防控该病的疫苗投入,更是数额巨大。目前,PRRS疫苗多采用Marc-145细胞进行生产,增殖的病毒滴度直接影响疫苗的有效性和生产成本。而Marc-145细胞存在繁殖病毒滴度低的问题。TBK1基因是宿主抗病毒天然免疫信号通路的重要枢纽,对于细胞干扰素的产生具有重要影响。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建TBK1基因敲除的Marc-145细胞株,以期提升病毒的滴度。首先,本研究针对TBK1基因多个转录本的同源区设计了2对sgRNA,以pSpCas9(BB)-2A-puro(PX459)质粒为载体,将退火形成双链的sgRNA与BbsI酶切线性化的PX459质粒相连接,成功构建了PX459+sgRNA重组质粒。使用脂质体2000转染试剂将重组质粒转染至生长状态良好的Marc-145细胞中,通过嘌呤霉素筛选,获得了多克隆细胞。再将多克隆细胞经有限稀释后,培养至96孔细胞板重,5d后每天在显微镜下观察,挑选出单克隆细胞。经一轮Touchdown PCR鉴定、二轮Touchdown PCR扩增送测序鉴定。结果共筛选出了两株TBK1基因敲除的Marc-145细胞,编号为1-3-A、2-2-18。再者,本研究选取了 3 株 HP-PRRS 毒株(JXA1-R、JXja-15、JXA1-E6)、2 株类 NADC30毒株(HNjz-15、20160802-32)、美洲型经典毒株VR2332及两株欧洲型毒株(180900-5、p073-3),接种细胞,测定病毒滴度。结果显示:两株欧洲毒株(180900-5、p073-3)在TBK1基因敲除后的细胞上均未产生细胞病变,与正常Marc-145细胞相比,两株TBK1基因敲除后的细胞在不同程度上提升了HP-PRRS毒株、类NADC30毒株及经典VR2332毒株的繁殖效力,提升幅度在3-12倍不等。综上所述,本研究为提升PRRS病毒的增殖滴度,提供了新的思路,且获得的1-3-A和2-2-18细胞株具备用于疫苗生产的潜力。