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[目的]原发性肝癌(primary carcinoma of liver, PCL)是全球第6位,中国第3位最常见的恶性肿瘤,包括原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)和原发性肝胆管癌两种主要类型,其中前者的发病率占PCL总发病率的90%以上。根据国际癌症研究中心估计,2000年全球肝癌发病总数为56.4万人,其中半数以上(约55%)发生在中国,即中国肝癌发病人数为30.6万人,而肝癌死亡人数则高达30.0万,而且在近些年原发性肝癌的发病率和死亡率仍有上升的趋势。目前肝癌的治疗仍以手术切除为首选,早期切除是提高患者生存率的关键;肿瘤越小,五年生存率越高。但是原发性肝癌起病常较隐匿,早期肝癌很难发现,一旦出现症状,大多数已到了中晚期。由于肝癌标志物AFP的使用,使肝癌的早期诊断和早期根治性手术治疗成为可能,但其敏感性难以满足临床需要,更为理想的肿瘤标志物还有待进一步的研究和探索。本研究的目的就是利用抗体技术和分泌蛋白的特性探索原发性肝癌新的肿瘤标志物。[方法]本研究利用高转移性肝癌细胞系HCCLM-6细胞总蛋白免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0融合建立杂交瘤细胞系,以HCCLM-6的细胞无血清培养上清和细胞总蛋白作为联合筛选抗原,通过ELISA法筛选细胞分泌蛋白以及肝癌细胞内的抗体。用免疫组化筛查对肝癌组织特异性高的抗体,并通过间接免疫荧光的方法鉴定其在不同转移性肝癌细胞系(高转移性细胞系HCCLM-6、低转移性细胞系HCC97-L、无转移性细胞系HepG2)、正常肝细胞系L-02和高转移性肺巨细胞癌细胞系95D中的分布情况;通过筛选Uni-ZAP XR成人肝脏cDNA表达文库对挑选出的具有肝癌特异性的单克隆抗体所识别的抗原进行鉴定,以期寻找更为理想和有效的原发性肝癌的诊断标志物。[结果]通过细胞融合实验建立小鼠抗人HCCLM-6的杂交瘤细胞株28株。通过间接酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫组织化学染色和间接免疫荧光等方法对所获得的28株单克隆抗体的肝癌特异性进行鉴定。ELISA检测的结果提示QGA062、QEC104、QAG013、QAC081、QFH307和QAG063这6株单克隆抗体在肝癌细胞系HCCLM-6总蛋白及HCCLM-6细胞无血清培养上清中的蛋白量均明显高于正常肝细胞系L-02及鼠骨髓瘤细胞系SP2/0。免疫组化和间接免疫荧光的鉴定结果提示有5株单克隆抗体即QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307能够比较特异地识别肝癌组织和不同肝癌细胞系中的蛋白,而在正常肝组织和正常肝细胞系L-02中则没有明显表达。结合间接酶联免疫吸附实验、免疫组织化学染色和间接免疫荧光的鉴定结果,挑选单克隆抗体QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307进行成人肝脏cDNA表达文库筛选,初步鉴定QAG013、QGA062、QAC081和QFH307这4株单克隆抗体所识别的抗原是纤维连接蛋白(fibronectin, FN)。以QAG013、QGA062、QAC081和QFH307阳性克隆剪切后质粒的诱导表达产物作为抗原,分别对这4株单克隆抗体进行Western blot鉴定,结合测序结果即阳性克隆插入片段的长度和插入位置对单克隆抗体所识别的抗原位置进行分析,结果提示4株单克隆抗体分别识别FN分子中3个不同的抗原表位,尤其是QGA062 mAb所识别的抗原表位仅在16个氨基酸(YTVSLVAIKGNQESPK)范围以内。对该段氨基酸序列进行人鼠同源性比较后发现二者仅在第4、8和13位氨基酸上存在差异,该肽段抗原表位分析的结果显示分析分值较高的区域位于该肽段的羧基端,提示第13位氨基酸很有可能在QGA062抗原表位的构成中发挥关键性作用,该肽段的发现为进一步研究FN与细胞粘附、新生血管形成和肿瘤之间的关系以及FN的新肿瘤相关位点奠定了基础。[结论]本研究利用杂交瘤技术制备小鼠抗人高转移性肝癌细胞系HCCLM-6的单克隆抗体28株,通过间接酶联免疫吸附实验、免疫组织化学染色和间接免疫荧光等方法确定其中5株单克隆抗体即QAG013、QGA062、QAC081、QAE018和QFH307在肝癌组织和不同肝癌细胞系中具有较高的特异性。成人肝脏cDNA表达文库筛选的结果提示单克隆抗体QAG013、QGA062、QAC081和QFH307所识别的抗原为FN,并且分别为FN分子中的3个不同抗原表位,尤其是QGA062 mAb所识别的抗原表位仅在16个氨基酸(YTVSLVAIKGNQESPK)范围以内,为进一步研究FN与细胞粘附、新生血管形成和肿瘤之间的关系以及FN的新肿瘤相关位点奠定了基础。