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目的:肝癌是一种常见的、病死率高的消化系统疾病。全球范围内已发生肝癌的患者中有近一半感染乙肝病毒,乙肝病毒的慢性感染与肝细胞肝癌的发生密切相关。研究表明抑制HBV复制对于预防肝癌的发生有十分重要的意义,多数慢性乙型肝炎患者经过抗病毒治疗可以实现HBV-DNA的阴转,却无法实现HBSAg的血清学转换,仍可以发生肝癌。研究表明编码HBsAg的序列片段PreS区可以发生突变,突变的肝细胞更容易发生癌变。而HBSAg消失或血清学转换既可以达到慢乙肝临床治愈,亦可显著降低肝癌的发生。因此,深入研究PreS区缺失突变对于肝癌细胞生物学行为的影响,构建稳定过表达乙肝病毒PreS/S蛋白野生型及突变型(PreS1缺失突变、PreS2缺失突变)的HepG2细胞株,探讨HBV PreS区突变对HepG2细胞生物学功能的影响意义深远。方法:本课题首先构建稳定过表达PreS区野生型及突变型(PreS1缺失突变、PreS2缺失突变)的HepG2细胞株,以NCBI中HBV病毒JX661479.1的PreS/S片段序列信息为模板,设计并确定PreS1突变、PreS2突变的核苷酸序列,采用全基因合成法获得目的片段并定向导入带有FLAG标签的pLVX慢病毒质粒载体(pLenti-CMV-3FLAG-PGK-Puro),PCR、双酶切、Sanger测序技术检测重组质粒中目的片段的准确性。其次,进行乙肝病毒preS区突变对肝癌细胞HepG2生物学行为的影响的研究,将HepG2细胞随机分为5组:空白对照组不做处理,阴性对照组、野生型组、PreS1突变组、PreS2突变组分别转染pLVX-vector、pLVX-PreS/S、pLVX-PreS1 mut/S、pLVX-PreS2 mut/S的慢病毒液,利用嘌呤霉素筛选HepG2稳定株,利用Western blotting技术对目的蛋白在HepG2中的表达情况进行鉴定。克隆形成、细胞划痕实验检测乙肝病毒preS区突变对肝癌细胞HepG2增殖活力、迁移能力的影响。结果:重组质粒进行单酶切鉴定证实没有发生载体自体连接的现象,双酶切鉴定在预期的目的片段大小位置可见条带显现。Sanger测序证实重组质粒目的片段核苷酸序列信息与设计乙肝病毒PreS区模板核苷酸序列信息相一致。经过嘌呤霉素浓度压力筛选,空白对照组HepG2细胞全部死亡,转染pLVX-vector,PreS/S野生型、PreS1突变型,PreS2突变型的HepG2细胞部分存活,继续浓度压力培养2天克隆传代,得到转染成功稳定过表达的HepG2细胞株。PreS2突变型的HepG2的14天克隆形成数及细胞相对迁移距离与其它组比较,p<0.05。结论:1.乙肝病毒PreS区野生型和突变型(PreS1缺失突变、PreS2缺失突变)的HepG2细胞株构建成功。2.乙肝病毒PreS区缺失突变相较于野生型肝癌HepG2细胞系增殖及迁移能力增强。3.乙肝病毒PreS2缺失突变较PreS1缺失突变具有更强的肝癌HepG2细胞系增殖和迁移能力。