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2010年GINA方案中哮喘的定义是：哮喘是由多种细胞和细胞组分共同参与的气道慢性炎症性疾病。由于气道内反复炎症损伤和反复修复的刺激,从而导致气道重塑的发生,这一病理变化在哮喘的早期、甚至在确诊哮喘前就已经出现了。因此我们推测气道重塑可能在哮喘的整个发病过程中都发挥了作用。白细胞介素-32(interleukin-32,IL-32)作为近年来新发现的一种细胞因子,很多文献证明其在炎症反应中有重要作用。2008年Calabrese[1]等研究发现IL-32在慢性阻塞性肺病(chronic obcsructive pulmonary disease,COPD)患者中高表达,参与了COPD的特殊免疫反应,由于COPD的发病机制与支气管哮喘有许多相似之处,因此我们推测IL-32也可能参与了哮喘的发病过程。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和基质金属蛋白酶9(matrix metallo proteinases-9,MMP-9)在哮喘气道重塑过程中的作用已得到大量研究证实,但IL-32在此过程中的作用及其与两者之间的相关性均未见报道。本实验中通过建立小鼠哮喘模型,研究IL-32、MMP-9和TNF-α在哮喘小鼠气道内的表达,以及三者在气道重塑过程中的作用机制,同时雾化吸入布地奈德行干预治疗,旨在为寻求用于哮喘诊断及分类的新的标记物,以及新的治疗靶向提供实验依据。目的通过检测哮喘小鼠气道内IL-32、MMP-9和TNF-α的表达,目的是为了探讨三者在哮喘气道重塑中的作用机制,以及布地奈德对它们在此过程中的干预作用,旨在为寻求用于哮喘诊断及分类的新的生物标记物,以及新的治疗靶向提供实验依据。材料与方法1实验动物分组及哮喘模型制作方法SDF级5-6周龄雌性小鼠30只,随机分为3组,即哮喘组(A组)、干预组(B组)和对照组(C组),每组10只。实验开始第1天、第8天和第15天,哮喘组每只小鼠腹腔注射卵清蛋白(ovalbumin,OVA)/氢氧化铝混悬液0.2ml行基础致敏,从第22天开始隔天1次,共7次,,雾化吸入2%OVA气溶胶进行激发,每次激发30分钟;干预组致敏和激发的方法与哮喘组相同,不同的是每次激发30分钟前,先雾化吸入30分钟1mg(2ml)布地奈德混悬液干预治疗对照组用生理盐水替代OVA,其方法和剂量均与哮喘组相同。2标本留取过程各组小鼠于末次雾化结束后24小时内,依次用乙醚麻醉,固定,开胸后从右心室插至肺动脉,生理盐水快速冲洗干净后,4%的甲醛溶液注入进行内固定,待小鼠全身僵硬固定后取左肺上叶,放入4%的甲醛溶液外固定24小时以上,然后酒精梯度脱水、石蜡包埋、切片,厚度约5um,最后做HE染色和免疫组织化学染色。3HE染色及免疫组织化学染色结果分析用Image Pro Plus6.0图像分析软件对实验结果进行分析,从HE染色图片中挑选出完整的、级别相同的支气管作为测量对象,分别测量气道壁厚度(um)和平滑肌层厚度(um),两者之差即为上皮粘膜层厚(um)。挑选出免疫组化染色清晰的图片,每张切片选择5个高倍镜视野,分别测定IL-32、MMP-9和TNF-α阳性区的平均光密度值,该切片的代表值即为这5个值的平均值。4统计学分析采用SPSS17.0软件对所得数据进行统计学分析。计量资料均用(x±S)表示。用单因素方差分析的方法对各组样本均数进行比较,用LSD-t检验方法进行各组间两两比较,用pearson相关性分析的方法进行各因素之间的相关性分析,以a=0.05为检验水准。结果1肺组织病理改变1.1大体改变哮喘组小鼠肺组织均轻度均匀膨胀,表面有不规则的暗红充血区,颜色显苍白和浑浊,切面处可见白色分泌物渗出。布地奈德干预组也有上述改变,但程度轻微。对照组未见上述改变。1.2病理学改变哮喘组小鼠肺内支气管粘膜下、支气管及血管周围炎性细胞浸润明显(包括嗜酸性粒细胞(Eosnophils,EOS)、中性粒细胞和淋巴细胞等),粘膜下水肿,粘液腺增生,分泌物增多,粘膜皱襞增多,气道上皮可见多处断裂和上皮细胞的脱落,细支气管平滑肌轻度肥大,支气管壁和基底膜增厚且形状不规则。干预组小鼠肺组织也可出现以上病理变化,但程度较哮喘组明显减轻。对照组小鼠肺组织未发现以上病理改变。2免疫组化结果2.1IL-32在哮喘组的表达(151.888±6.863)显著高于对照组(100.706±7.410),布地奈德干预后IL-32的表达水平(121.702±5.421)明显低于哮喘组的表达,P<0.05。2.2TNF-α在哮喘组的表达(147.657±7.756)显著高于对照组(114.813±9.809),布地奈德干预后TNF-α的表达水平(137.326±9.487)明显低于哮喘组,P<0.05。2.3MMP-9在哮喘组的表达(148.936±9.818)显著高于对照组(110.689±4.796),布地奈德干预后MMP-9的表达水平(128.027±10.900)明显低于哮喘组,P<0.05。3相关性分析3.1IL-32与TNF-α在气道内的表达呈正相关(r=0.835,P<0.01),与气道壁厚度呈正相关(r=0.897,P<0.01)。3.2TNF-α与MMP-9在气道内的表达呈正相关(r=0.924,P<0.01),与气道壁厚度呈正相关(r=0.907,P<0.01)。3.3MMP-9与IL-32在气道内的表达呈正相关(r=0.895,P<0.01),与气道壁厚度呈正相关(r=0.944,P<0.01)。结论(1)IL-32、MMP-9及TNF-a通过炎症级联反应,参与了哮喘气道重塑过程,三者在气道重塑发生过程中有相互协同作用。(2)布地奈德吸入治疗可通过降低IL-32、MMP-9及TNF-α在哮喘小鼠气道内的表达而改善气道重塑。