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目的:本研究通过不同浓度的环丙沙星对敏感的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginoisa,PA）进行体外诱导,探讨不同的浓度及诱导时间对铜绿假单胞菌耐药性、毒力因子和群体感应（quorum sensing,QS）相关基因的影响,进而探索环丙沙星在诱导过程中是否参与了QS对毒力因子的调控,为临床合理使用喹诺酮类药物提供依据。一、环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌耐药性的影响方法:1.实验菌株的选择:将课题组前期收集的20122013年临床分离的铜绿假单胞菌非重复性菌株40株经VITEK-2重新鉴定,通过测定菌株对环丙沙星的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentrations,MICs）,筛选出对环丙沙星敏感的菌株,最后选择其中来源于无菌体液和伤口分泌物的菌株与PAO1一起组成本研究的实验菌株。2.环丙沙星体外诱导实验:根据各实验菌株对环丙沙星的MICs值,将各菌株分别接种于相应的0.5×MIC,1×MIC,2×MIC和4×MIC四个浓度的含环丙沙星琼脂培养皿中,共传代培养5天,其中诱导1天时的菌株定义为1代菌,诱导2天则定义为2代菌,依次类推。分别保存其中1、3、5代菌株备用。3.耐药性的测定及统计分析:采用琼脂倍比稀释法测定所有保存的菌株对环丙沙星的MICs,统计不同诱导浓度及不同时间的耐药率变化。MICs经lg转化后采用重复测量方差分析的方法研究不同浓度的环丙沙星诱导5代对铜绿假单胞菌MICs的影响。P<0.05则差异有统计学意义。结果:1.实验菌株的选择:课题组前期收集的40株非重复性铜绿假单胞菌的标本类型主要以痰标本26株（65%）为主,其次还有伤口分泌物5株（12.5%）、尿3株（7.5%）和血2株（5%）等。标本来源于临床各住院科室,其中分离到最多的是ICU 7株（17.5%）和呼吸科7株（17.5%）,其次还有血液科6株（15%）、神经科5株（12.5%）和骨科5株（12.5%）等。40株菌中有31株对环丙沙星敏感（77.5%）,其中来源于无菌体液和伤口分泌物中的菌株共11株,与PAO1共同构成实验菌株12株。2.环丙沙星体外诱导实验:12株菌经0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC四个浓度共诱导5代,其中分别有2株菌在4×MIC浓度、有1株菌在2×MIC浓度连续培养48小时未有生长而弃去,因此共弃去9株菌,诱导成功并保存135株。3.耐药性的测定及统计分析:测定所有诱导成功菌株对环丙沙星的MICs值,结果显示,各浓度诱导均使耐药率随时间逐渐升高,到第5代,耐药率增加到58.33%100.00%。经重复测量方差分析,诱导时间与浓度交互作用显著（P<0.001）,即随诱导时间的延长,各诱导浓度的MICs变化趋势不同,1、3和5代增速最快的浓度分别为4×MIC、4×MIC和2×MIC。主效应诱导时间之间差异显著（P<0.001）,即诱导过程中MICs逐渐增大且增速逐渐减缓。诱导因素浓度间差异显著（P=0.001）,即诱导MICs增大的能力4×MIC>2×MIC>0.5×MIC>1×MIC。二、环丙沙星体外诱导对铜绿假单胞菌毒力因子的影响方法:1.泳动能力:用接种针挑取单个菌落插入胰蛋白胨泳动平板上,32℃培养16h,测量浑浊圈直径。所有诱导前后的菌株均重复三次实验。2.绿脓菌素:采用双向萃取法（氯仿与盐酸）测定绿脓菌素的活性,取OD520/OD600表示绿脓菌素活性。所有诱导前后的菌株均重复三次实验。3.统计分析:采用重复测量方差分析的方法研究不同浓度的环丙沙星诱导5代对铜绿假单胞菌毒力因子（泳动能力,绿脓菌素）的影响。单因素分析方法根据资料的正态性选择t检验或Kruskal-Wallis秩和检验。结果:1.泳动能力:经重复测量方差分析,诱导时间与诱导浓度的交互作用无显著差异（P=0.157）,即随诱导时间延长,各浓度的泳动能力变化趋势相同。主效应诱导时间之间差异显著（P<0.001）,即随诱导时间延长铜绿假单胞菌泳动能力先抑制后促进。诱导浓度之间无明显差异（P=0.910）,但单效应分析结果显示,0.5×MIC和1×MIC浓度的环丙沙星随时间抑制作用逐渐减弱,促进作用逐渐增强;而2×MIC和4×MIC只有促进作用,且随时间变化不明显。研究还发现,诱导1天时各浓度对铜绿假单胞菌的泳动能力均有弱的抑制作用;诱导3天时各浓度均有弱的促进作用;到第5天,各诱导浓度的促进作用有所差别,其中0.5×MIC最强,4×MIC最弱。2.绿脓菌素:经重复测量方差分析,诱导时间与诱导浓度的交互作用无显著差异（P=0.528）,即随诱导时间延长,各浓度的绿脓菌素变化趋势相同。主效应诱导时间之间无差异显著（P=0.404）,诱导浓度之间亦无明显差异（P=0.901）,即环丙沙星各浓度对铜绿假单胞菌诱导的5天内,绿脓菌素被相似程度的促进。但值得注意的是,4×MIC浓度可抑制菌株的绿脓菌素,且抑制作用随诱导时间延长而逐渐增强。三、环丙沙星诱导对铜绿假单胞菌QS相关基因表达量的影响方法:1.菌株的筛选:剔除12株实验菌中诱导不完整的菌株,进一步采用随机数据表法随机筛选3株与PAO1及各自的诱导菌一起构成基因实验组菌株。2.QS相关基因表达量的测定:提取菌株的总RNA,逆转录合成cDNA,设计PA QS相关基因lasR,lasI,rhlI,rhlR以及pqsR的引物,以GAPDH为内参基因,经RT-PCR扩增,绘制扩增曲线,测定基因表达量2-△△CT。3.统计分析:采用重复测量方差分析的方法研究不同浓度的环丙沙星诱导5代对铜绿假单胞菌QS相关基因表达量的影响。单因素分析方法根据资料的正态性选择t检验或Kruskal-Wallis秩和检验。QS基因与MICs;QS基因与毒力因子（泳动能力、绿脓菌素）;QS各基因间的相关性采用Pearson相关系数分析。结果:1.菌株的筛选:剔除12株实验菌中诱导不完整的菌株后得到9株（包括PAO1）。进一步采用随机数据表法从其中除PAO1外的8株菌中随机筛选出3株菌,与PAO1及各自的诱导菌一起构成实验菌共52株。QS相关基因的表达量:经重复测量方差分析,诱导时间与浓度之间无交互作用（P>0.05）,即随诱导时间的延长,各环丙沙星浓度的QS各相关基因表达量均下调作用逐渐减弱,上调作用逐渐增强,且上调强度依次为:rhlR>lasI>lasR>pqsR>rhlI。主因素诱导时间:lasR和pqsR基因的代数之间无差异（P均>0.05）,即环丙沙星不同时间的诱导相似程度的上调lasR和pqsR基因的表达;lasI,rhlI及rhlR基因的代数间差异显著（P均<0.05）,即lasI和rhlI基因随时间先下调后上调、而rhlR基因随时间上调作用逐渐加强。各基因的诱导因素浓度之间均无差异（P均>0.05）,即不同浓度的诱导使lasI,lasR,rhlI,rhlR及pqsR基因的表达量相似程度的上调。2.QS相关基因与表型的关系:统计结果显示,环丙沙星诱导过程中lasI,lasR,rhlI基因的表达与MICs的逐步升高有一定的相关性（P均<0.05,r均>0）;rhlR基因与泳动能力的先抑制后促进作用低度相关（P均<0.05,r=0.417）;各基因的表达与绿脓菌素的促进作用均相关性不显著（P均>0.05）。3.QS相关基因之间的相关性:环丙沙星诱导过程中铜绿假单胞菌lasI,lasR,rhlI,rhl R及pqs R基因的表达量之间均存在一定的正相关（P均<0.05,r均>0）,这提示铜绿假单胞菌中QS系统是错综复杂、相互关联的,因此很难确定毒力因子的表达是由某一个基因独立调控的。且相关性程度结果发现lasI和lasR均与其它基因有3个高度相关关系（r均≥0.8）和1个中度相关关系（0.5≤r<0.8）,比较其它基因的相关关系程度更大,提示las系统可能为QS系统的主要调控系统。结论:1.环丙沙星诱导使铜绿假单胞菌MICs逐渐增大且增速逐渐减缓,诱导能力:4×MIC>2×MIC>0.5×MIC>1×MIC。2.低浓度环丙沙星诱导使铜绿假单胞菌的泳动能力先抑制后促进,而高浓度使其相似程度的促进。3.各浓度环丙沙星的诱导使铜绿假单胞菌的绿脓菌素相似程度的促进。4.环丙沙星的诱导使铜绿假单胞菌lasI和rhlI基因先下调后上调、rhlR基因持续上调。5.铜绿假单胞菌lasI,lasR,rhlI基因的表达与MICs的变化有一定的相关性;rhlR基因的表达与泳动能力低度相关。