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桑黄是已知生物抗癌领域有效率最高的大型真菌,近年来由于过度开采,桑黄野生资源匮乏,人工培养技术尚不成熟,使其成为真菌类药物研究和开发的热点。目前关于桑黄的文献资料报道主要集中在人工培养、抗癌机理及功能成分的研究。但人工培养还处于实验室阶段,抗癌机理和有效成分的研究尚不清楚。本论文选用日本桑黄和韩国桑黄两个菌种,采用固体发酵法培养菌丝体和子实体,通过单因素和正交试验确定液体培养条件进行液体纯菌丝的培养。利用水提醇沉法提取固体菌质、子实体和菌丝中的多糖。以环磷酰胺抗肿瘤药物为对照,建立小鼠S180肿瘤移植模型,对不同培养条件下提取得桑黄多糖进行抑瘤效果的评价。利用薄层层析和岛津GC-14B气相色谱进行单糖组成分析。
试验结果显示:固体菌质培养的主料分别为棉籽壳和锯末,相对于韩国桑黄,日本桑黄菌丝萌发、生长速度稍快。子实体的培养基以棉籽壳为主料,韩国桑黄子实体的分化、发育和成熟时间只需日本桑黄的1/2~2/3,分别为17~19d、19~24d和32~40d。韩国桑黄成熟子实体呈半球形,白黄色,日本桑黄呈马蹄形,黑褐色。桑黄菌的液体培养最适碳源为玉米粉,最适氮源为麸皮,最佳发酵培养基配方为(g/L):玉米粉45、麸皮25、KH2PO42、MgSO4·7H2O1。最适发酵参数为:接种量15%(V/V)、培养温度27℃、摇瓶转速160r/min、装液量160mL/500mL三角瓶、培养时间160h。在上述条件下桑黄最大菌丝生成量1.42g(干菌丝)/100mL。
影响桑黄多糖提取率的主要因素是提取次数,其次分别为提取时间、提取温度和料液比。确定最佳提取工艺组合为:提取2次,95℃提取2h,料液比1:50.在此提取条件下,子实体多糖提取率分别为3.69%(H)、6.27%(R),菌丝体(H)提取率为4.4%,固体菌质多糖平均提取率为2.87%~3.72%。
100只小白鼠随机平均分成10组,分别为空白组、阴性对照组、阳性对照组和桑黄多糖组。空白组和阴性对照组给水,阳性对照组喂以环磷酰胺,多糖灌胃剂量为200mg/(Kg·bw)。实验结果表明肿瘤生长正常,药物无毒性反应。桑黄子实体(R)抗癌效果最强,高达72.64%,子实体(H)为52.36%,菌丝体为32.51%,固体菌质多糖抗癌效果不明显。
多糖经DEAE-52纤维素柱层析,脱色效果明显,韩国桑黄子实体多糖略带黄色,日本桑黄子实体多糖为乳白色。本试验采用薄层层析法(TLC)对桑黄子实体多糖的单糖组成定性分析。展开剂为:乙酸乙酯:吡啶:乙酸:水=10:11:2:3,各种单糖的Rf值为:鼠李糖0.727,木糖0.576,葡萄糖0.303,阿拉伯糖0.412,果糖0.504,甘露糖0.504,半乳糖0.212。气象色谱对多糖中的单糖定量分析,结果表明:韩国桑黄(H)单糖组成为鼠李糖,阿拉伯糖,葡萄糖,甘露糖和半乳糖,含量分别为0.258mg/mL,0.524mg/mL,9.875mg/mL,0.905mg/mL,0.659mg/mL,回收率为97.2%。日本桑黄(R)单糖组成为鼠李糖,阿拉伯糖,木糖,葡萄糖,甘露糖和半乳糖,含量分别为0.102mg/mL,0.386mg/mL,0.184mg/mL,1.652mg/mL,0.282mg/mL,0.168mg/mL,回收率为95.8%。
本实验结果为桑黄这一抗癌性药用菌物资源的开发利用以及抗癌机理研究提供了一定的实验依据,具有一定的科学性和应用价值。