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棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）作为我国重要的小型、底栖经济鱼类,广泛分布于我国河口地区及沿海海域。棘头梅童鱼的肉质细腻,味道鲜美,终年可以捕获,深受沿海居民的喜爱。然而,棘头梅童鱼有限的种群规模和繁衍速率难以满足市场需求,现已出现过度捕捞和种群衰退的危险。课题组已对我国沿海地区棘头梅童鱼群体遗传结构进行了系统研究,并正在开展棘头梅童鱼规模化繁育技术攻关与研究工作。目前,棘头梅童鱼缺少转录组学及基因组学信息,对棘头梅童鱼细胞学与生殖学方面的研究尚未见报道。对棘头梅童鱼生殖细胞发育及相关调控机制的研究,不论对棘头梅童鱼遗传基础的深入系统研究,还是产业化开发都有很深远的意义。本研究基于Illumina HiSeqTMM 500测序平台,对棘头梅童鱼成熟精巢和卵巢进行转录组测序,经de nove组装,得到与棘头梅童鱼生殖发育相关的基因及信号通路;通过克隆得到生殖细胞特异基因dnd、dmrt1、foxl2和vasa cDNA全长序列,并对它们的表达模式和功能进行分析研究;最后通过数据库预测参与棘头梅童鱼生殖发育调控的microRNA。本研究结果不仅可以丰富棘头梅童鱼转录组学信息数据库,为深入研究棘头梅童鱼生殖细胞发育机制提供理论基础;而且可以为棘头梅童鱼种质资源保护和合理开发提供重要的依据。具体研究内容如下:1.棘头梅童鱼转录组测序与差异分析利用Illumina NextSeq TM 500测序平台,对棘头梅童鱼成熟精巢、卵巢组织转录本进行从头组装、拼接和功能注释,从得到的大量转录本信息中筛选参与性别决定、生殖细胞发生发育等过程的差异表达基因。测序结果分析鉴定的clean reads为精巢57,087,688条,卵巢60,867,978条;包含189,181个转录本（transcript）和131,168个非重复序列（unigene）。将转录本数据导入NR、GO、KEGG Pathway数据库比对发现,棘头梅童鱼与斑马宫丽鱼（Maylandia zebra）基因序列相似性最高（26%）;27,708个unigene通过GO功能注释后,发现有650个unigene与生殖和生殖过程相关;12,883个unigene映射到KEGG Pathway通路上,其中“信号转导机制”通路富集的unigene最多,占总数的14.6%。结合转录组测序数据筛选出12个性腺特异基因,利用荧光定量PCR（qPCR）分析了它们在棘头梅童鱼成体组织中的表达情况,相关结果与测序结果一致。2.棘头梅童鱼dnd/dmrt1/foxl2/vasa基因的克隆与表达模式研究在上一章筛选到的性腺差异基因中选择dnd、dmrt1、foxl2和vasa基因作进一步研究分析。使用RACEs克隆方法获得了四个基因cDNA全长序列,并发现其在结构和进化关系上都具有极高的保守性。组织特异性分析结果显示:棘头梅童鱼dmrt1只能在精巢中检测到明显信号,在其他体细胞组织和卵巢中都未检测到信号;foxl2在脑、心脏和卵巢中都有表达,但精巢中无可检测信号;dnd和vasa mRNA则只在性腺中有特异表达,且精巢和卵巢中的表达量无明显差异。利用原位杂交（ISH）技术进一步确定dnd、dmrt1、foxl2和vasa基因在棘头梅童鱼成熟性腺中的亚细胞定位情况。结果显示:dmrt1基因定位于精巢的次级精母细胞、精子和睾丸间质细胞中,并未在卵巢中检测到信号;foxl2基因定位于卵巢的卵母细胞和颗粒细胞中,在精巢中未检测信号。结果具有明显的性别二态性,与RT-PCR结果保持一致,说明棘头梅童鱼dmrt1和foxl2基因在精巢和卵巢的发育以及性别分化过程中承担着重要的作用。vasa和dnd基因均在生殖细胞的细胞质中表达,具有相似的表达模式:RNA表达量在精原细胞中最高,并随着精子发生过程而逐渐减少,信号最终消失在精子中;在卵巢中均呈现出先升高后降低的趋势,RNA信号在卵原细胞中较为微弱,在早期卵母细胞中变强,最后在晚期卵母细胞和卵子中很难被检测到。采用双色荧光原位杂交技术（FISH）比较了vasa/dnd的亚细胞定位差异,结果显示:vasa基因在I期卵母细胞中存在特殊的表达形式,即在细胞质中形成高强信号的核周斑块,不同于dnd基因在细胞质中均匀分布。这说明vasa和dnd基因在棘头梅童鱼生殖细胞发生过程中不仅各自扮演着重要的角色,也存在着相互协同的部分。此外,本研究还构建了融合有荧光蛋白的棘头梅童鱼vasa/dnd 3’UTR重组质粒,并反转录成mRNA。利用RNA定点表达技术（LRE）发现,棘头梅童鱼vasa/dnd 3’UTR可诱导绿色荧光蛋白（GFP）在生殖细胞中稳定表达,成功标记了青鳉胚胎PGCs,具有标记基因的保守功能,可用以观察PGCs在胚胎中的迁移情况。3.棘头梅童鱼生殖发育相关microRNA预测利用miBase、miRWalk、TargetSCAN等数据库预测发现,棘头梅童鱼vasa和dnd 3’UTR均与miR-430保守的种子序列（CGUGAAA）有多个碱基的互补。通过已经得到的dnd/dmrt1/foxl2/vasa mRNA序列,反向预测可能参与转录后调控的microRNA（miRNA）。随后对筛选到的miRNA进行qPCR验证其在棘头梅童鱼成体组织中的表达情况,得到6个具有明显性腺特异性的miRNA。其中,mir-10-38和mir-54只在精巢中表达;mir-143-5,mir-202-2和mir-430-4在精巢中的表达量明显高于卵巢;mir-1260b-1则主要在卵巢中表达。这些miRNA的靶向调控基因以及是否在生殖发育过程中发挥作用还需要进一步确定。