研究目的:探究ABCB1和ABCG2介导帕比司他耐药的作用机制。研究内容:肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance,MDR)是恶性肿瘤诊疗过程中的巨大障碍。多药耐药的发生,可以使肿瘤细胞同时对结构不同、来源不同的多种抗肿瘤药物同时发生治疗抵抗,极大的缩短了肿瘤患者的总生存期。与肿瘤细胞多药耐药相关的机制有多种,其中ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白介导的肿瘤细胞多药耐药是药物蓄积水平降低的主要原因。帕比司他(panobinostat)是FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的二线用药,是一种强效的组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂,具有较好的体内外抗肿瘤活性。我们的前期工作发现,帕比司他在过表达ABCB1和ABCG2转运蛋白的肿瘤多药耐药细胞中的活性显著下调,提示ABC转运蛋白可能介导帕比司他耐药。在本研究中,我们将主要探究ABCB1和ABCG2介导帕比司他耐药的作用及相关的机制研究。研究方法:(1)利用MTT比色法评价帕比司他对过表达ABCB1的肿瘤细胞以及对应的亲本细胞增殖抑制活性的差异;(2)利用MTT比色法评价帕比司他对过表达ABCG2的肿瘤细胞以及对应的亲本细胞增殖抑制活性的差异;(3)利用MTT比色法评价帕比司他在转染ABCB1或ABCG2全长基因的HEK293细胞中的增殖抑制活性,并与亲本细胞比较活性差异;(4)探究已报道的部分ABC转运蛋白抑制剂对ABC转运蛋白介导的帕比司他耐药的逆转作用;(5)利用Western blot法评价帕比司他对ABCB1和ABCG2蛋白表达水平的影响;并利用免疫荧光法评价帕比司他对ABCB1和ABCG2蛋白亚细胞定位的影响;(6)以同位素标记的抗肿瘤药物(氚标紫杉醇和氚标米托蒽醌)为探针,评价帕比司他对上述抗肿瘤药物在过表达ABCB1和ABCG2细胞中的蓄积水平的影响;(7)利用钒敏感的ATP酶试验评价帕比司他对ABCB1和ABCG2的ATP酶活性的影响;(8)利用in silico分子模拟对接评价帕比司他与ABCB1和ABCG2底物结合空腔的潜在结合位点。结果帕比司他对过表达ABCB1和ABCG2的细胞敏感程度显著降低,同时,已报道的部分ABC转运蛋白逆转剂可逆转ABC转运蛋白介导的帕比司他耐药。机制研究方面,帕比司他上调ABCB1和ABCG2的表达水平,但不改变其亚细胞定位。此外,帕比司他上调氚标紫杉醇和氚标米托蒽醌在肿瘤多药耐药细胞中的蓄积水平,并激活ABCB1和ABCG2的ATP酶活性。计算机模拟分子对接结果显示,帕比司他可以氢键和π键方式与ABCB1和ABCG2底物结合空腔分别结合。结论帕比司他上调ABC转运蛋白的表达水平,同时可激活ABCB1和ABCG2的ATP酶活性,并且与ABCB1和ABCG2的底物结合空腔结合,进而被ABC转运蛋白泵出,造成细胞内帕比司他蓄积水平的降低,导致帕比司他耐药的发生。本研究明确了ABC转运蛋白在帕比司他耐药过程中的作用,并详细阐述了其具体的作用机制,这将为帕比司他进一步临床的联合应用提供理论依据。