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肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)严重威胁人类健康。化学治疗是目前HCC治疗最常用手段之一。化学治疗药物索拉非尼(Sorafenib,SF)是首个被美国FDA批准用于晚期HCC治疗的药物,之后被多个临床治疗指南推荐为HCC治疗的一线药物。然而,SF存在一定的免疫抑制作用,其通过诱导肿瘤微环境缺氧,促进T细胞表面免疫检验点的高表达而引起肿瘤免疫逃逸,降低了其临床治疗效果。因此,本课题基于化学免疫联合治疗理念,在SF化学治疗的基础上联用免疫检验点抑制剂,在直接杀伤肿瘤细胞的同时重新激活免疫系统,发挥联合抗肿瘤作用,以提高HCC治疗效果。T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3单克隆抗体(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3 monoclonal antibody,Tim-3 mAb)可阻断 SF 引起的 T 细胞免疫抑制通路,重新激活T细胞而发挥杀伤肿瘤细胞的作用,是免疫检验点抑制剂领域研究热点。Tim-3 mAb与SF的联用能够以不同机制杀伤肿瘤细胞,并缓解SF引起的免疫抑制,改善SF治疗预后,具有良好的HCC治疗前景。然而,SF为水难溶性药物,口服生物利用度低,且存在胃肠道出血等毒副作用;Tim-3 mAb为蛋白类药物,不适于口服,亦存在免疫相关毒副作用。二者性质差异大,均存在非期望的药代动力学分布现象,因此需选用合适的药物递送策略对其进行共递送,以协同两种治疗机理,提高疗效。介孔二氧化硅纳米粒(Mesoporoussilicananoparticles,MSNs)具备被动靶向、药物共载以及药物控释等多种功能,为解决上述问题提供了良好的策略。基于上述设计理念,本课题以MSNs为药物载体,设计了两类药物控释系统:①pH响应“开关型”载SF MSNs药物控释系统,②MMP2响应型SF和Tim-3 mAb共载MSNs药物控释系统,旨在化学治疗和化学免疫联合治疗两个层面上对HCC进行治疗,以提高HCC治疗效果,降低药物毒副作用。第一层面,选用SF为HCC化疗药物,以生物相容性好且生物可降解的pH敏感材料聚组氨酸(Poly(L-histidine),PLH)为 MSNs 的“Gatekeeper”,以聚乙二醇(Poly(ethylene glycol),PEG)为 MSNs 亲水“Coating”,设计构建了 pH 响应“开关型”载SFMSNs药物控释系统(SF/MSNs-PLH-PEG),用于HCC化学治疗,以提高HCC治疗效果。第二层面,选用SF为HCC化疗药物,Tim-3 mAb为HCC免疫治疗药物和“Gatekeeper”,通过基质金属蛋白酶2(Matrix met-alloproteinase 2,MMP2)敏感肽将 Tim-3 mAb 连接于 MSNs 表面,设计构建了MMP2响应型SF和Tim-3 mAb共载MSNs药物控释系统(SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb),用于HCC化学免疫联合治疗,以实现SF和Tim-3 mAb的异靶点共递送,进一步提高HCC治疗效果。本课题主要研究内容及结果如下:1.SF含量测定方法建立使用高效液相色谱法法建立SF含量测定方法,结果表明SF在1～30 μg/mL浓度范围内线性良好(R2=0.9999)。日内、日间精密度RSD均小于2%,方法回收率在98%～102%之间且RSD小于2%,符合方法学测定要求。2.p pH响应“开关型”载SFMSNs的构建、表征及体内外评价通过溶胶凝胶法合成MSNs,通过溶剂挥发法对MSNs进行载药,通过“graft to”策略将PLH及PEG依次共价修饰于MSNs,制备SF/MSNs-PLH-PEG。通过透射电镜法、电位法、红外光谱法、氮气吸附法、热重分析法以及小角度X射线散射法对其进行系统性表征。结果表明,SF/MSNs-PLH-PEG成功构建;MSNs-PLH-PEG粒径约为160nm;SF/MSNs-PLH-PEG电位为-(13.8±1.7)mV;SF载药量约为(22.5 ±2.5)%。通过透析袋法考察SF/MSNs-PLH-PEG在不同pH条件下的体外释放行为,SF/MSNs-PLH-PEG中SF在pH 5.0条件下的累计释放量显著高于pH 7.4(p<0.01),表明SF/MSNs-PLH-PEG具有pH敏感释药特性,且随释放介质pH值的改变,SF释放速率也发生明显变化,表明其具有“开关”功能。通过MTT法考察体外细胞毒性,SF/MSNs-PLH-PEG对HepG2细胞具有良好的抗增殖作用,表明其良好的体外抗肿瘤活性。通过抑瘤实验考察体内抗肿瘤效果,SF/MSNs-PLH-PEG 组小鼠瘤重低于 SF/MSNs 组(p<0.05),SF/MSNs-PLH-PEG组小鼠体重与生理盐水组相当(p>0.05),表明其良好的体内抗肿瘤活性和安全性。溶血试验中,SF/MSNs-PLH-PEG在实验浓度内未出现肉眼可见溶血现象且溶血百分率均小于5%,表明其血液相容性良好。在小鼠主要器官H&E染色实验中,MSNs-PLH-PEG组未发现任何肉眼可见损伤,表明其组织相容性良好。以上实验结果表明SF/MSNs-PLH-PEG具有pH响应“开关”功能、良好的体内外药效以及安全性。3.MMP2响应型SF和Tim-3 mAb共载MSNs的构建、表征及体内外评价通过MMP2敏感肽将Tim-3 mAb共价修饰于SF/MSNs,制备SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb。通过透射电镜法、红外光谱法、氮气吸附法、热重分析法以及小角度X射线散射法对其进行系统性表征。结果表明,SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb 成功构建;MSNs-pep-Tim-3 mAb 粒径约为 150 nm,电位为-(22.3±1.9)mV;SF 载药量为(13.5±3.1)%,Tim-3 mAb 载药量约(10.1±0.1)%。通过透析袋法和离心法考察SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb的体外释放行为,SF和Tim-3 mAb在含酶条件下的累计释放量显著高于无酶条件(p<0.01),表明SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb具有MMP2敏感释药特性。通过MTT法考察体外细胞毒性,SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb在HepG2和H22细胞上具有与游离SF相当的细胞毒性,表明其具有良好的体外抗肿瘤活性;通过抑瘤实验考察体内抗肿瘤效果,SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb组小鼠瘤重低于SF和Tim-3 mAb混合溶液组(p<0.05),表明其良好的体内抗肿瘤活性。细胞共培养实验中,HepG2对DiI的摄取率显著高于Jurkat细胞(_p<0.01),而对Tim-3 mAb的摄取率显著低于 Jurkat 细胞(p<0.01),说明 DiI/MSNs-pep-Tim-3 mAb 中 DiI 主要进入肿瘤细胞,而Tim-3 mAb主要进入T细胞,表明其具有异靶点药物共递送能力。通过Ki-67染色、H&E染色和Tunel染色进一步评价其体内抗肿瘤效果,结果表明SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb具有最优的抗肿瘤细胞增殖及促肿瘤细胞凋亡效果。免疫学评价实验中,SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb可增加免疫促进因子IFN-γ和IL-12的表达,具有缓解SF免疫抑制的作用。溶血实验中,SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb在实验浓度内未出现肉眼可见溶血现象且溶血百分率均小于5%,表明其血液相容性良好。在主要器官H&E染色实验中,SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb组未发现任何肉眼可见损伤,表明其组织相容性良好。以上实验结果表明SF/MSNs-pep-Tim-3 mAb具有MMP2敏感释药能力、优秀的体内外药效、抗肿瘤细胞增殖及促肿瘤细胞凋亡效果、改善SF免疫抑制的作用以及良好的安全性。综上,本研究基于化学免疫联合治疗的理念,构建刺激响应型异靶点药物共递送系统,同时装载化疗药物与免疫治疗药物。该系统兼具被动靶向、刺激响应型释药、异靶点药物共递送等多种功能,为肿瘤的化学免疫联合治疗提供了新思路、新策略。