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MTB W541蛋白是由MTB增殖期抗原Ag85A和Ag85B及潜伏相关抗原Rv3407和Rv1733c构成的新型多抗原表位串联DNA疫苗编码的蛋白。本研究应用生物信息学方法首先预测和分析W541蛋白的结构及功能;然后构建小鼠LTBI模型,免疫接种W541 DNA疫苗后,再注射激素以激活潜伏的MTB,通过检测其免疫学、细菌学和病理学指标评价该疫苗抑制LTBI激活的预防效果。一、结核分枝杆菌重组W541蛋白的生物信息学分析本实验室构建的新型MTB DNA疫苗编码蛋白W541的氨基酸序列分别利用生物信息学软件进行分析,如应用Prot Param预测蛋白理化性质;应用Protscale预测蛋白亲（疏）水性;应用TMHMM、PSORT和Signal P预测蛋白跨膜区域、信号肽和亚细胞定位;应用SOPMA和SWISS-MODEL分别预测蛋白二级和三级结构;应用Net NGlyc和Net Phos分别预测蛋白的糖基化修饰位点和磷酸化位点;应用IEDB、SYFPEITHI、RANKPEP、Net MHC和Net CTL分别预测蛋白B细胞、Th和CTL表位,应用STRING和EXPASY分别预测蛋白相互作用网络及与人类蛋白的同源性。结果显示W541蛋白的分子式为C3329H5035N923O993S24,是一个由704个氨基酸构成的亲水性不稳定膜蛋白,无跨膜螺旋区及信号肽,不稳定指数为45.37;其二级结构中无规则卷曲占优势（42.47%）,也存在α-螺旋、β-折叠和β-转角（分别占比26.99%、19.03%和11.51%）;有6个糖基化位点;62个磷酸化位点主要是丝氨酸（35个）、苏氨酸（15个）和酪氨酸（12个）磷酸化位点;具有T细胞和B细胞优势表位;W541蛋白与10个蛋白有相互作用;该蛋白的氨基酸序列与人蛋白的同源性低于3.3%。二、W541 DNA疫苗对小鼠结核潜伏感染模型预防效果的研究101只雌性42-62日龄、体重16g～18g小鼠（BALB/c）被随机分配至下列11组:（1）MTB感染4周组（5只）;（2）MTB感染16周组（8只）;（3）MTB感染29周组（10只）;（4）化疗12周组（8只）;（5）化疗停药13周组（10只）;（6）生理盐水组（即激素治疗停药3周组,10只）;（7）p VAX1载体组（10只）;（8）微卡菌苗组（10只）;（9）ag85ab质粒DNA组（10只）;（10）W541质粒DNA组（10只）;（11）正常对照组（10只）。然后进行小鼠LTBI模型的制备及治疗:（1）91只小鼠经尾静脉注射0.4ml含3.6×10~5菌落形成单位（Colony-forming units,CFUs）的MTB标准株H37Rv悬液,制备小鼠LTBI模型;（2）MTB感染4周后,给小鼠每天饮用含8g/L吡嗪酰胺和0.12g/L异烟肼的水12周,建立小鼠LTBI模型;（3）MTB感染后16周,小鼠LTBI模型分别用100μl生理盐水、100μg/100μl p VAX1载体、22.5μg/100μl微卡、100μg/100μl ag85ab质粒DNA组、100μg/100μl W541质粒DNA通过肌肉注射治疗小鼠LTBI模型,每两周一次,连续免疫3次;（4）第3次免疫结束后3周,肌肉注射0.5mg/100μl氢化可的松琥珀酸钠,每周3次,连续3周,建立小鼠LTBI激活模型;（5）终止激素治疗后,观察4周处死所有小鼠,计算小鼠脏器重量指数、脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞斑点数、Fox P3调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）比例,应用流式细胞术微球阵列（cytometric bead array,CBA）方法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中Th1（IFN-γ）、Th2型（IL-4）细胞因子水平,观察肺、肝活菌计数及肺组织病理改变,以判断治疗效果。结果显示,感染29周组和感染16周组肺脏器重量指数显著高于感染4周组、化疗12周组和化疗停药13周组（P＜0.0001）,感染4周组和化疗12周组显著高于化疗停药13周组（P＜0.05）。感染29周组和感染16周组肝脏重量指数显著高于感染4周组和化疗后停药13周组（P＜0.0001）,化疗12周组显著高于感染4周组和化疗停药13周组（P＜0.0001）,感染4周组显著高于化疗停药13周组（P＜0.05）。感染29周组和感染16周组的脾脏重量指数均显著高于感染4周组,化疗12周组和化疗停止13周组（P＜0.0001）,感染4周组显著高于化疗停止13周组（P＜0.05）。LTBI模型各治疗组小鼠肺、肝和脾脏重量指数之间差异没有统计学意义（P＞0.05）。小鼠LTBI模型中止激素治疗3周时,正常对照组、生理盐水组、p VAX-1载体组和微卡菌苗组均可见少量的W541蛋白特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞;ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组均可见中等量的W541蛋白特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞。与正常对照组、生理盐水组、p VAX-1载体组和微卡菌苗组比较,ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组分泌IFN-γ的T淋巴细胞显著增加（P＜0.0001或P＜0.01）,ag85ab质粒DNA组分泌IFN-γ的T淋巴细胞数也显著高于W541质粒DNA组（P＜0.05）,生理盐水组、p VAX-1载体组和微卡菌苗组分泌IFN-γ的T淋巴细胞数显著高于正常对照组（P＜0.0001或P＜0.05）,生理盐水组分泌IFN-γ的T淋巴细胞数显著高于p VAX-1载体组（P＜0.01）。各治疗组小鼠脾细胞中Fox P3Treg（CD4+CD25+FOXP3+Treg）的百分比显著低于正常对照组（P＜0.0001）,微卡菌苗组、ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组小鼠脾细胞中的CD4+CD25+FOXP3+Treg百分比显著高于生理盐水组和p VAX-1载体组（P＜0.0001或P＜0.01或P＜0.05）。Ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平显著高于3个阴性对照组（正常对照组、生理盐水组、p VAX-1载体组）和阳性对照微卡组（P＜0.0001或P＜0.01或P＜0.05）。ag85ab质粒DNA组脾细胞培养上清中IL-2水平显著高于p VAX-1载体组、微卡菌苗组和正常对照组（P＜0.0001或P＜0.01或P＜0.05）,W541质粒DNA组和生理盐水组也显著高于正常对照组（P＜0.0001或P＜0.05）。与生理盐水组和p VAX-1载体组比较,三个疫苗组脾细胞培养上清中IL-4水平略有降低,但差别没有统计学意义（P＞0.05）。与p VAX-1载体组和正常对照组比较,三个疫苗组脾细胞培养上清中IL-6水平略有升高,但差别没有统计学意义（P＞0.05）。MTB感染4周组小鼠肺菌落数为7.78Log10,说明成功地建立了小鼠MTB感染模型。化疗12周组肺菌落数减少到0 CFU,说明化疗有效,抑制了小鼠肺内活跃增殖的MTB,成功地建立了小鼠LTBI模型。随着MTB感染时间的延长,感染16周组和感染29周组肺菌落数分别为6.90Log10和7.33Log10,略有降低,说明BALB/c小鼠对MTB具有一定的天然抵抗力。小鼠LTBI模型经3周激素治疗后停药3周时,生理盐水组和载体组肺CFUs值由化疗后的0分别增加至4.07Log10和5.20 Log10,提示小鼠体内经化疗后潜伏的MTB出现内源性复燃,证明成功地建立了小鼠LTBI激活模型。用疫苗对小鼠进行预防性治疗后,再用激素激活小鼠体内潜伏的MTB,以评价疫苗预防LTBI活化的效果。与生理盐水组和p VAX-1载体组相比,三个疫苗治疗组小鼠肺菌落数和肝脏菌落数均不同程度降低,ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组小鼠肝脏菌落数均为0CFU,说明微卡菌苗组、ag85ab质粒DNA组、W541质粒DNA组对潜伏的MTB均具有一定的免疫抑制及清除作用,可降低小鼠脏器荷菌量,抑制潜伏的MTB复燃。各组小鼠肺组织病理结果显示W541质粒DNA组、微卡菌苗组和ag85ab质粒DNA组的小鼠肺部病变范围均小于生理盐水组和p VAX-1载体组。综上所述,MTB表位串联蛋白W541以T细胞抗原表位为主、B细胞抗原表位为辅,免疫原性良好,与人类同源性极低。W541 DNA疫苗主要诱导Th1型免疫应答,可显著增强特异性细胞免疫功能,预防性治疗小鼠LTBI模型,可使其肺、肝脏组织细菌数减少,肺组织病变范围显著减少,病变减轻,其治疗效果与现有商品化的LTBI预防治疗制剂微卡菌苗的预防效果相当,为新型LTBI疫苗的研制奠定了良好的基础。