研究背景：体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)技术自二十世纪五十年代成功用于临床以来,已成为心内直视手术的必备手段,随着科学技术的进步,体外循环机器和相关管道材料的改良,术中心肌保护、灌注技术以及围手术期监护治疗水平的进步,CPB手术的安全性大大提高,但是CPB带来的非生理性的血流灌注仍可诱发全身性炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),导致术后各脏器系统不同程度的损伤。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是SIRS的早中期改变,症状轻的患者仅为亚临床表现,而重症患者则表现为ALI,甚至是急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。ALI/ARDS会显著延长病人术后呼吸机应用时间、ICU滞留时间等,不但增加了家庭及社会负担,而且增加患者的死亡率,严重影响预后。因此,研究CPB对肺的损伤机制以及探索行之有效的肺保护方法,对CPB手术患者术后肺功能的恢复及远期生存至关重要。α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)是一种具有蛋白酶抑制作用的急性时相反应蛋白,分子量为5.2kDa,是血浆中主要的蛋白酶抑制物,能抑制中性粒细胞弹性蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶、血浆素等蛋白酶的活性,可以保护机体内的正常组织避免蛋白酶的损伤。最近的研究表明αl-AT可抑制炎症反应过程中的多个环节,抑制炎症介质和细胞因子的过度释放,减少PMN的激活,清除超氧阴离子、自由基等活性氧,维持氧化/抗氧化物的动态平衡,避免过度应激对机体自身的损伤,继而具有防治肺损伤的功效。本研究从炎症因子的释放、细胞凋亡、氧化-抗氧化角度探讨α1-AT对CPB术后肺功能的保护作用。第一部分血浆晚期氧化蛋白产物浓度与急性肺损伤的相关性研究目的：急性肺损伤(ALI)是体外循环(CPB)心脏手术后常见的并发症。本研究拟观察CPB心脏直视手术围术期内血浆晚期氧化蛋白产物(AOPPs)的水平变化,明确氧化应激与CPB术后ALI的相关性,以及AOPPs预测CPB术后ALI的有效性。内容与方法：本研究为前瞻性研究,经南方医科大学南方医院伦理委员会同意批准,将2014年1月1日至5月31日南方医院胸心外科在CPB下行心脏手术的患者纳入本研究。参考1994年欧美联系会议制定的ALI诊断标准,根据患者CPB手术后是否发生ALI,将患者分为ALI组和非ALI组。在术前、术后1小时、术后12小时、术后24小时和术后48小时获得患者全血2m1。采用ELISA方法检测血浆中AOPPs的浓度。研究所涉及的计量数据,均先通过one-sample Kolmogorov-smimov检验进行正态分布检验。Student’s t检验或Mann-WhitneyU检验检测两组之间各指标的差异。应用多因素逐步Logistic (stepwise logistic)回归模型分析AOPPs与ALI发生发展的相关性,以受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积(AUC)评价这个生物学指标的回归模型对ALI的诊断价值。所有统计学分析采用SPSS 22.0软件进行分析,P<0.05为有显著性差异。结果:在本研究期间共有70例符合本研究纳入标准的、在CPB下行心脏手术的成人患者,其中18人(25.7%)发生ALI。ALI组患者慢性阻塞性肺病、高血压的患病率高于非ALI组。ALI组患者住院时间和重症监护时间较非ALI组患者明显延长。CPB结束后,所有患者血浆中AOPPs的浓度较术前明显升高,并且在术后1小时开始升高,术后12小时开始下降。ALI组患者CPB术后1小时、12小时、24小时、48小时AOPPs浓度明显高于非ALI组患者。非ALI组患者血浆AOPPs浓度在术后24小时降至基线水平,ALI组患者血浆AOPPs浓度在术后1小时达到峰值,术后12小时快速下降,在术后24小时再次升高。通过多因素回归分析显示,CPB术后1小时血浆中AOPPs浓度(OR=1.164,95% CI 1.068-1.269, P=0.001)、术前合并慢性阻塞性肺病(OR=28.706,95% CI 1.770-465.640, P=0.018)是术后ALI发生的独立危险因素。通过ROC曲线分析CPB术后1小时血浆AOPPs浓度对术后ALI的诊断价值,结果显示曲线下面积为0.875(95%置信区间,0.774-0.942),诊断截断值为81.89μmol/L。结论：本研究表明,CPB术后血浆中AOPPs的浓度明显升高,其升高水平与肺损伤程度明显相关。血浆中AOPPs是CPB术ALI早期可靠的预测指标。AOPPs在CPB术后肺损伤的临床表现和病情进展中的作用还需要进一步的研究。第二部分α1-抗胰蛋白酶对体外循环肺损伤保护作用的实验研究目的：1、应用α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)对体外循环(CPB)术后急性肺损伤(ALI)比格犬进行干预,从氧化-抗氧化角度说明其对肺脏具有保护作用。2、研究α1-AT对比格犬CPB术后肺部炎症反应的抑制作用,并探讨其抑制炎症的作用机制。内容与方法：1、急性肺损伤模型的建立。选取成年健康比格犬30只(14.5±0.63)kg,随机分为3组,Ⅰ组(空白对照组),Ⅱ组(CBP术后AL1组),Ⅲ组(CPB术后ALI+α1-AT干预组)。采用2%戊巴比妥钠静脉麻醉(剂量30mg/kg),CPB手术过程中用微量泵持续泵入维持麻醉效果(剂量10 mg/kg/h)。比格犬取仰卧位,固定后经口气管插管(根据体重选取合适管径),连接呼吸机辅助通气,设置呼吸频率18次/min,潮气量15 ml/kg,右侧颈内静脉及右侧股动脉穿刺置管,用导管鞘的侧管连接PiCCO的温度探头,右股动脉导管用于连接PICCO的监护仪。Ⅰ组仅行正中开胸手术,不行CPB。Ⅱ、Ⅲ组建立CPB,在CPB期间阻闭左肺动脉并行右侧肺单肺通气,同时连续监测动脉血气分析。2、给药方法及监测指标。Ⅲ组在预充液中加入50 mg/kg剂量的α1-AT。分别记录各组动物T1：CPB手术前,T2:CPB转机后30分钟,T3：CPB转机后2小时,T4：CPB结束后6小时,T5:CPB结束后12小时的心率、血压、氧饱和度等生命体征,在每个时间点留动脉血标本,用于实时监测血气分析及其他炎症指标的检测。根据PaO2、FiO2计算氧合指数；通过脉搏指示连续心排血量监测技术(PiCCO监测技术)连续监测血管外肺水指数(EVLWI)、肺毛细血管通透性指数(PVPI)。术后12小时处死比格犬,收集肺组织标本及支气管肺泡灌洗液(BALF)标本。检测各时间点血清TNF-α、IL-8、MMP-9、AOPPs浓度,BALF标本测定蛋白含量,肺组织标本测定髓过氧化物酶(MPO)丙二醛(MDA)活力,以及肺湿/干重比值及肺含水量,并行组织病理学检查。结果：1、血气分析与血流动力学监测结果：CPB术后急性肺损伤组(对照组)氧合指数较空白对照组显著降低(P<0.001),应用α1-AT干预(实验组)可以明显提高比格犬氧合指数,改善组织氧合。PiCCO监测结果也显示应用α1-AT干预可以明显降低EVLW、PVPI等血流动力学指标。2、与空白对照组比较,对照组、实验组比格犬CPB术后血浆IL-8, TNF-a,MMP-9浓度均明显升高(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。与对照组比较,使用α1-AT预处理能显著降低这些炎症因子与蛋白酶的水平。3、急性肺损伤过程中氧化应激直接导致了肺损伤,急性肺损伤组、α1-AT干预组血浆AOPPs浓度、肺组织MPO、MDA活性均较空白对照组显著升高(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。应用α1-AT干预能明显降低肺组织内的MPO、MDA的活性(P<0.001,P<0.001),以及血浆AOPPs的浓度(P<0.001),明显减轻了氧化应激导致的肺组织损伤。4、病理学检查发现α1-AT干预组比格犬的肺间质水肿、中性粒细胞浸润、肺泡透明膜形成、肺组织出血、坏死等变化均较急性肺损伤组(对照组)明显减轻。结论：1、α1-AT可有效减轻比格犬CPB术后肺损伤,改善肺功能和组织氧合、降低血管外肺水指数及毛细血管通透性指数,减轻肺水肿。2、α1-AT能显著减少比格犬CPB术后肺组织中炎症因子及蛋白酶的表达,减轻炎症反应。3、α1-AT通过减少活性氧生成,抑制氧化应激对肺部的损害来实现其保护肺功能的作用。第三部分 α1-抗挗蛋白酶对人肺泡上皮细胞氧化应激损伤的保护作用目的：本研究以体外培养的人肺泡上皮细胞(HPAEpiC细胞)为研究对象,用H2O2处理HPAEpiC细胞,建立细胞氧化应激损伤模型,观察氧化应激下,HPAEpiC细胞的活性氧(ROS)生成、细胞存活率,FasL、Fas、cleaved caspase-8、caspase-3、 caspase-9、以及UCP-2的表达变化,以及预先给予α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)能否减少ROS生成、下调凋亡相关蛋白、提高细胞存活率。初步探讨α1-AT对肺泡上皮细胞氧化应激损伤的保护作用。内容与方法：实验分为空白对照组、对照组(H2O2处理组)和实验组(H2O2处理与α1-AT (2mg/ml)干预组),以浓度为500μmol/L的H2O2处理HPAEpiC细胞24 h。采用激光共聚焦显微镜检测HPAEpiC细胞线粒体ROS产生,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,采用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹法(Western blotting)测定FasL、Fas、cleaved caspase-8、caspase-3、 caspase-9、以及UCP-2的表达变化。结果：1、与空白对照组比较,对照组的HPAEpiC细胞在H2O2的作用下凋亡率明显升高(P<0.05),同时FasL、Fas、以及cleaved caspase-8表达显著上调。实验组加入α1-AT后,HPAEpiC细胞凋亡率明显下降(P<0.05), FasL、Fas以及cleaved caspase-8表达也相应下调。2、与空白对照组比较,对照组的HPAEpiC细胞caspase-3、caspase-9表达显著上调,而UCP-2表达下降(P<0.05)。实验组加入α1-AT后,HPAEpiC细胞caspase-3、caspase-9表达也相应下调,而UCP-2表达上调(P<0.05)。结论：1、氧化应激可以激活外源性凋亡通路,上调Fas、FasL、cleaved caspase-8表达,导致HPAEpiC细胞凋亡。2、氧化应激可以激活内源性凋亡通路,上调caspase-3、caspase-9表达,导致HPAEpiC细胞凋亡。3、α1-AT可以通过下调Fas、FasL、caspase-8表达抑制外源性通路介导的HPAEpiC细胞凋亡；通过下调caspase-3、caspase-9表达抑制线粒体通路介导的HPAEpiC细胞凋亡。4、α1-AT通过上调UCP-2减少HPAEpiC细胞内ROS的生成。