烧伤是以皮肤热力损伤为始发因素的特殊类型的创伤，创面问题是烧伤的根本问题，如何尽早有效修复封闭暴露的创面是烧伤治疗的根本任务。只有烧伤创面得到及时的封闭与修复，才能有效防止水电解质、营养物质的丢失以及病原微生物的入侵等各种并发症的发生。有关创面修复与愈合的研究较多，但至今创面修复与愈合机理仍不十分明确。研究表明，表皮干细胞(Epidermal Stem Cells, ESCs)在皮肤组织损伤自行修复过程中起着举足轻重的作用。浅度烧伤创面自行愈合主要依靠创面或创周残存的表皮干细胞增殖、分化、迁移至损伤部位，并最终发挥创面修复功能。研究发现，表皮干细胞主要存在于皮肤基底膜或毛囊外鞘隆突部等处，它通过表达整合素(整联蛋白，integrin)等粘附分子与皮肤内细胞及细胞外基质如胶原、层粘蛋白(laminin)、纤维蛋白(Fibrin)等结合，而锚定于特定微环境或称为壁龛(niche)的巢穴中。只有在某些外部因素作用下，它才能离开其固有巢穴，而仅有当ESCs离开其固有巢穴后才具有分裂增殖、迁移等功能。所以表皮干细胞的离巢迁移是其发挥其创面修复功能最关键的步骤。我们的前期研究发现，在烧伤创面修复过程中形成的肉芽组织及早期瘢痕中，P311基因高表达；已有研究证实P311参与多种组织修复，提示P311可能在烧创伤创面修复过程中起着重要作用。有文献报道强制性高表达P311的胶质瘤细胞、肌成纤维细胞的迁移能力明显增强；我们前期试验结果提示P311可促进体外培养的HaCaT细胞迁移，因此推测P311可增强表皮干细胞迁移能力，进而促进烧伤创面愈合。为了证实这一假设，我们首先用免疫组化方法，探索在动物模型中P311与烧伤创面修复及表皮干细胞迁移的关系；再设计并构建P311腺病毒表达载体，感染分离培养的表皮干细胞，在体外创伤模型中观察P311高表达后对表皮干细胞迁移功能的影响。研究内容和方法：1.在小鼠浅Ⅱ°烧伤创面中表皮干细胞表达P311的实验研究1).小鼠浅Ⅱ°烧伤模型的制作：使用YLS-Q5超级台式温控烫伤仪致伤C57BL/6小鼠。使用自重500g，底部面积2cm2恒温金属烫头垂直接触小鼠皮肤3s，筛选65℃和80℃两致伤温度。经HE染色观察烧伤皮肤组织学改变，确定小鼠浅Ⅱ°烧伤模型的制作条件。2).免疫组化方法观察烧伤创面P311表达情况：18只C57BL/6成年雄性小鼠随机分为6组，其中在5组小鼠背部制作浅Ⅱ°烧伤创面，伤后6h、12h、24h、48h、72h等不同时相点的创面与正常皮肤交界处取材。以未做烧伤处理的小鼠正常皮肤作为对照。取材后迅速4%多聚甲醛固定24小时，石蜡包埋，切片。免疫组织化学染色，镜下观察P311表达情况。3).免疫组化方法观察烧伤创面新生表皮中，表皮干细胞的P311的表达情况：(1)采用新出生小鼠腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-21-deoxyuridine,BrdU)方法标记表皮干细胞，于标记7周后制作浅Ⅱ°烧伤创面。72h取材制作蜡块，组织连续切片4μm/张，分别使用的兔抗人P311多克隆抗体和小鼠抗BrdU单克隆抗体做免疫组化染色，对比连续切片中BrdU阳性细胞及P311阳性细胞位置关系。(2)上述组织块切片依次使用BrdU抗体和P311抗体进行免疫组化双重染色，经过氧化物酶和碱性磷酸酶标记，分别通过DAB和BCIP/NBT显色观察BrdU标记的表皮干细胞表达P311情况。2.高表达P311对体外培养的表皮干细胞迁移的影响1). P311腺病毒表达载体及空载体的构建，腺病毒的包装、扩增、纯化、滴度测定以本实验室所构建质粒pDsRed-P311作为模板，PCR扩增P311基因，并与Myc标签序列连接；以不连接P311基因的Myc序列作为空载对照。二者分别连接至穿梭质粒pAdTrack，在感受态大肠杆菌BJ5183中与骨架质粒pAdEasy同源重组，经PCR技术及特异性酶切技术验证构建的载体。腺病毒载体在293细胞中包装、扩增，根据腺病毒纯化、脱盐、快速滴度测定试剂盒说明书进行相关操作。将腺病毒滴度调整一致为1×10~9IU/ml并用于体外实验研究。2). P311在体外创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响应用快速粘附法分离培养表皮干细胞，将P2代表皮干细胞均匀接种至12孔板，每孔1×10~4个细胞。细胞融合至70%时，按病毒颗粒数：细胞数=100:1加入腺病毒感染细胞24h。继续培养至细胞生长融合90%时，加入抑制细胞增殖的丝裂霉素致终浓度4μg/ml，培养2h后，进行划痕操作。划痕后0h、12h、24h、36h、48h、72h显微镜下观察划痕处细胞迁移情况。每孔选择2处固定位置，每个时相点均在该处拍照，测量划痕宽度，计算细胞迁移距离。实验数据用均数±标准误(x±s)表示，每时相点组间使用独立样本t检验，以p<0.05为两组之间具有显著性差异。实验结果：1.P311在小鼠浅Ⅱ°烧伤创面表达，浅Ⅱ°烧伤创面新生表皮细胞表达P3111).确定小鼠浅Ⅱ°烧伤模型的制作条件：根据HE染色结果得出：烧伤温度65℃时，创面的病理诊断为浅Ⅱ°烧伤；同条件下烧伤温度为80℃时，创面的病理诊断为深Ⅱ°或Ⅲ°烧伤。在后续实验中致伤C57BL/6小鼠制作浅Ⅱ°烧伤模型，选用YLS-Q5超级台式温控烫伤仪，致伤温度为65℃，致伤时间为3s，致伤压力为金属烫头自重。2).小鼠浅Ⅱ°烧伤创面及创周不同时期P311表达量不同正常皮肤结构完整，细胞排列整齐，P311免疫组化染色仅在皮脂腺部位有非特异性阳性信号，其他部位均未见P311表达。皮肤经浅Ⅱ°烧伤后6h，创面表皮完全坏死，创面部位真皮中未受损毛囊以及新生表皮细胞中可见表达P311的细胞。P311在这些部位持续表达，强度随烧伤后时间增加而逐渐增强，直至烧伤后72h仍可见大量阳性细胞。创周区域烧伤后6h，表皮及毛囊细胞即少量表达P311，表达强度在12h达峰后逐渐回落，72h已降至正常皮肤水平。3).在烧伤创面新生表皮中，表皮干细胞表达P311：采用BrdU标记表皮干细胞方法，小鼠注射BrdU后饲养至7周，BrdU免疫组化结果可以检测到阳性细胞。(1)连续切片分别经BrdU及P311免疫组织化学染色后，发现新生表皮中存在BrdU阳性细胞及表达P311细胞，且二者定位基本一致。(2)免疫组化双重染色的方法也证实了这一结论。2.高表达P311对体外培养的表皮干细胞迁移的影响1).经PCR鉴定和酶切鉴定高表达P311基因的腺病毒载体及空载体构建正确。经包装、扩增、纯化后得到的腺病毒滴度为1×109IU/ml。2). P311在体外创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响实验发现感染腺病毒pAdEasy-P311后，表皮干细胞迁移能力较感染等量pAdEasy-Myc显著增强，这种差异在划痕后各时相点均有表现，并且进行性增加。划痕后12h、24h、36h、48h和72h，P311组表皮干细胞迁移距离[(63.87±10.14μm)，(113.30±17.50)μm，(195.12±27.39)μm，(430.38±64.64)μm，(618.60±46.28)μm]与对照组各时相点细胞迁移的距离[(24.56±4.91)μm，(45.92±8.35μ)m，(68.77±10.6)μm，(135.39±24.45)μm，(296.18±64.26)μm]相比差异显著，p<0.01。实验结论：在体动物实验研究发现，在烧伤创面新生表皮中表达P311的细胞来源于表皮干细胞；体外实验证实强制表达P311可促进表皮干细胞的迁移。因此本实验研究提示P311可能在烧伤后表皮干细胞迁移、创面再上皮化中起着重要作用。