肿瘤的发生缘于机体内细胞增殖与凋亡之间动态平衡的破坏，凋亡过程抑制或失效，一方面不能有效清除已有损伤而又无法修复的细胞，使细胞逃避免疫监视；另一方面导致细胞存活期延长而堆积，为不稳定基因发生遗传学改变提供基础，引起细胞转化和肿瘤生长。近年来对凋亡发生和调控机制的研究表明，细胞凋亡途径主要有两条：线粒体途径和死亡受体途径。两条途径都与一类天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)的活化关系密切，尽管它们的启动过程不尽相同。 Caspase是与秀丽隐杆线虫死亡蛋白CED在基因序列和蛋白质结构上高度同源的一个蛋白家族，该家族蛋白是细胞凋亡执行的重要分子，直接参与凋亡启动、凋亡信号传递及凋亡效应过程。其中caspase 3蛋白是细胞凋亡的主要效应因子，在凋亡过程中处于中心地位。体外实验发现caspase 3基因的单碱基变异导致氨基酸改变W206R是caspase 3蛋白失活的重要原因。我们及其他研究小组也曾发现caspase 3蛋白表达异常与多种肿瘤，如淋巴瘤、胃癌、非小细胞肺癌等有关，这种异常是否与基因的多态性、突变有关，目前国内外的报道不多。 Fas／FasL系统是组织细胞凋亡的主要诱导者，Fas也称CD95或APO-1，是死亡信号传递的一个关键分子。近年来的研究表明，凋亡抑制是B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)的普遍现象，大多数B-NHL表现出对Fas凋亡途径的拮抗，而且与肿瘤的进展及预后有关。然而，目前对该拮抗机制的研究尚处于初步阶段。我们及其他研究小组先后发现，Fas蛋白及凋亡通路中主要蛋白的表达和功能在多种拮抗Fas凋亡的B-NHL细胞中未见异常。进一步研究发现，细胞对Fas凋亡的拮抗可能与一些凋亡调节性蛋白的异常表达有关，如c-FLIP蛋白、IAPs蛋白、Myc蛋白和可溶性Fas蛋白等。同时，人们也陆续报道了Fas基因变异对Fas蛋白表达的影响及与B-NHL的关系，基因突变浙江大学硕士学位论文引起Fas蛋白表达水平的改变被认为是MALT型淋巴瘤发生的早期步骤:弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、间变型淋巴瘤(ALCL)中也均有Fas基因突变发现。然而，基因突变在各亚型B一NHL中作用的研究还刚起步，探讨Fas基因变异对细眼凋亡的影响，对B一NHL发病机制的阐明有着重要的意义。 单核普酸多态性(SNPs)是人类基因组中含量最丰富的多态性标记，约占基因组多态性的90%。人类基因组计划证实，SNP的种类和频率在不同种族间存在差异，而且，位于基因调控区和编码区的SNP能影响基因的转录、蛋白的表达及功能，被视为“微效基因”，这也是各类常见疾病表现型和治疗反应性在个体间存在差异的物质基础之一。次序位于染色体上的SNP位点根据彼此间的LD关系能将染色体划分成不同的“单倍型块(haPlotyPe bins/blooks)”，构建单倍型块不仅能使sNP的多态信息含量最大化，还能使用于疾病关联分析的SNP数目最小化。Fas基因启动子区多态性位点及构成的单倍型(haPlotyPe)与宫颈癌、自身免疫淋巴增殖综合征及急性髓样白血病的关系已有报道。目前，有关汉族人群caspase3基因、Fas基因遗传多态性数据及与B-N’HL的关联分析尚未见报道，值得我们研究。 本研究应用PCR、变性高效液相色谱技术(DHPLC)和DNA测序技术检测浙江地区汉族正常人群和63例B一NHL患者中。aspase3基因、Fas基因编码区及部分调控区序列，以期定位其上的SNP和体细胞突变位点，分析两个人群遗传特征的异同，在SNP、基因突变与B一NHL发病相关性研究的新领域作一点探索性的实验研究。_._二_.__…~.__._.___._.…_._鱼丝互大学硕士学位业文一一一一一一一一一一一一一 材料与方法1材料 (l)正常人标本:收集2002年9月至12月间浙江省人民医院门诊检查者的外周血261人份，均为汉族人。盐析法抽提墓因组DNA。 (2)淋巴瘤标本:收集1997一2003年我医学院附属医院及省内其它医院63例B一NHL标本，均为汉族。全部标本经中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4、5四连续切片，除常规HE染色外，还采用免疫组化SP法标记淋巴瘤细胞亚群，根据肿瘤细胞的免疫表型和形态学表现诊断为B一NHL。按照2001年WHO关于淋巴造血组织肿瘤分类对所有病例进行分类。酚一氯仿法抽提组织DNA。2方法 用01190 6.0软件设计扩增caspase3基因部分5’端调控区、3’端调控区和全部蛋白质编码区(外显子2一7)的引物12对;参照文献设计扩增Fas基因部分启动子区和绝大部分蛋白质编码区(外显子2一9)的引物12对。PCR扩增正常人外周血标本和B一NHL石蜡组织标本中正常组织DNA，用DHPLC法筛查DNA片段上的单核普酸多态性位点，经ONA测序法确定含阳性DHPLC峰型样品的碱基突变位置和类型。根据最大期望值法，估算位点间的配对连锁不平衡关系和单倍型频率，比较汉族正常人群 和B一NHL患者在多态位点的基因型、等位基因频率，位点间的连锁不平衡关系及单倍 型分布等方面的差异，分析与B一N’HL发生的关系。 扩增B一NHL石蜡组织标本中肿瘤组织的基因组DNA，筛查基因上的突变位点，分 析与B一NHL发生的关