研究背景和目的破骨细胞是一类起源于造血干细胞的成体细胞,它们大部分贴附于骨表面,可以分泌多种酸和溶解酶来降解骨组织。在机体代谢稳定时,只有少量的破骨细胞生成,与成骨细胞相协调,参加骨重塑。近来,研究人员发现破骨细胞还参与机体防御与修复,炎性疾病以及肿瘤的骨转移。破骨细胞的发育很大程度上受到其所在的细胞微环境的影响,其周围的细胞分泌多种重要细胞因子,表达细胞表面分子来调节破骨细胞的生成。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)最早在骨髓中被发现,适宜的条件下能分化为多种细胞。MSCs及其分化的细胞是骨髓微环境中的主要支持细胞。MSCs借助细胞因子和/或细胞间直接接触,调节大多数造血细胞的存活、增殖和分化。虽然MSCs和破骨细胞都位于骨髓微环境中,然而,有关MSCs和破骨细胞之间联系的研究却不多。本研究借助于一种可靠高效的小鼠MSCs分离培养方法,着重研究了MSCs受到肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)刺激后,对破骨细胞的抑制作用及其机制。并借助类风湿关节炎病人的关节腔液( rheumatoid arthritis synovial fluid, RASF)和脂多糖注射小鼠模型,探究了MSCs在体外和体内复杂炎性微环境中对破骨细胞的调节作用。同时,初步研究了RASF来源的MSCs对破骨细胞的调节作用。研究方法1、采用骨实质分离培养法获得小鼠MSCs,对其进行三系诱导分化鉴定。以流式分析其免疫表型。2、分离小鼠CD11b+单核细胞,将其与MSCs共培养,部分培养组内再添加巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)和核因子κB的受体激活子配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL),观察MSCs对于单核细胞来源的破骨细胞分化、成熟、存活和骨吸收能力的影响。3、以TNF-α预处理MSCs,然后再用于和单核细胞共同培养。有些实验组中,直接添加TNF-α到MSCs和单核细胞的共培养体系中去。上述实验组同样应用于象牙片共培养试验,检测破骨细胞的骨吸收能力。接下来,采用transwell培养法把MSCs和单核细胞共同培养但是避免直接接触,再进一步采用RT-PCR,real-time PCR和ELISA来分析MSCs中破骨细胞生成抑制因子-骨保护素(osteoprotegerin, OPG)的表达情况以及MSCs受到TNF-α刺激后,OPG在mRNA和分泌蛋白水平的变化。分析TNF-α刺激后,MSCs中破骨细胞生成促进因子RANKL, M-CSF和白细胞介素6 (Interleukin, IL-6)的mRNA表达情况。4、在此基础上,采用western-blot检测MSCs受到TNF-α刺激后,其中P38/MAPK, ERK/MAPK和JNK/SAPK通路有无发生活化。采用这三条通路相应的通路抑制剂来预处理MSCs,再给予TNF-α刺激,然后以real-time PCR检测MSCs中OPG的mRNA水平。同时,采用通路抑制剂来预处理MSCs,再给予TNF-α刺激,然后以单核细胞共同培养,观察MAPK通路活化对于破骨细胞生成的影响。5、分别对TNF-α刺激后的MSCs免疫学表型和多向分化能力做检测。同时,采用CFSE标记法,观察TNF-α刺激过的MSCs能否抑制Con A引起的CD3+T淋巴细胞增殖。6、采集20例RASF样本,以ELISA法测定各样本中的TNF-α浓度。以RASF样本刺激MSCs,再把MSCs和单核细胞共同培养,观察破骨细胞生成的情况。7、经尾静脉给脂多糖小鼠注射MSCs,取小鼠股骨做病理切片,做原位抗酒石酸的酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色,观察破骨细胞生成情况。8、从RASF中分离得到RASF-MSCs,将其与人CD14+单核细胞共同培养,以TRAP染色判断其对破骨细胞生成的影响。研究结果1、以骨实质法从单只小鼠取材培养,可以在14天时获得107以上数量的MSCs。收获的细胞具备成骨、成脂肪和成软骨三系分化能力,具有经典的MSCs免疫表型。2、MSCs能够单独或者与M-CSF和RANKL协同促进单核细胞分化为破骨细胞,这种促进作用与MSCs的数量和共培养时间成正相关。MSCs还能够将培养体系中的TRAP+且多个细胞核的成熟破骨细胞占全部TRAP+细胞中的比例由19%提高到39%。添加了MSCs之后,长期存活的破骨细胞数量比没有添加MSCs的实验组多了接近两倍。3、TNF-α刺激之后,MSCs转为抑制单核细胞向破骨细胞分化,这种抑制作用与TNF-α的浓度和刺激时间成正相关。TNF-α刺激之后的MSCs,在MSCs和单核细胞数量比例较低的时候就开始抑制破骨细胞生成,在二者比例1:5的时候即发挥抑制作用。这种抑制破骨细胞生成的作用较为持久,可达到12天以上。培养体系中直接添加TNF-α会产生更强烈的抑制效果。4、MSCs和TNF-α刺激之后的MSCs对破骨细胞的骨吸收能力发挥不同的调节作用。无TNF-α时,MSCs促进破骨细胞在成象牙片上形成较大的骨吸收陷窝;以TNF-α预处理MSCs或者直接把TNF-α添加到共培养体系中,象牙片上的骨吸收陷窝很小或者没有骨吸收陷窝形成。5、Transwell实验表明MSCs分泌的可溶性分子在调节破骨细胞分化和功能方面起着重要作用。RT-PCR结果表明MSCs表达多种破骨细胞的调节因子包括RANKL, M-CSF, IL-6和OPG。Real-time PCR结果显示TNF-α能上调MSCs中OPG的mRNA表达,这种上调作用与TNF-α的浓度和作用时间成正相关。与之相对应,ELISA结果显示TNF-α促进MSCs分泌OPG,这种促进作用与TNF-α的浓度成正相关。Real-time PCR结果显示TNF-α略微下调了MSCs中RANKL, IL-6和M-CSF的mRNA水平。6、Western blot结果显示TNF-α引发了MSCs中p38/MAPK, ERK/MAPK和JNK/SAPK通路的活化。Real-time PCR结果显示p38/MAPK通路的抑制剂SB23580HCL和JNK/SAPK通路的抑制剂JNK inhibitor II,能部分取消TNF-α引起的MSCs中OPG的mRNA上调,而ERK/MAPK通路的抑制剂PD98059则没有类似作用。破骨细胞培养结果与之相似, SB23580HCL和JNK inhibitor II,能部分取消TNF-α活化的MSCs抑制破骨细胞的作用,而PD98059则没有类似作用。7、TNF-α活化的MSCs保持了其细胞形态,免疫表型和多向分化能力,可以抑制Con A引起的CD3+T淋巴细胞增殖。8、RASF处理后,MSCs对破骨细胞生成的调节作用发生了变化。当样本中TNF-α浓度较低的时候,MSCs促进破骨细胞的生成;当样本中TNF-α浓度较高的时候,MSCs抑制破骨细胞的生成。9、小鼠股骨切片的TRAP染色结果显示:给予脂多糖小鼠输注MSCs后,能减少其体内破骨细胞的生成。10、RASF-MSCs具有经典的MSC免疫表型,但是与人骨髓MSCs相比,其多向分化能力有所下降。当其与单核细胞共培养时,促进破骨细胞生成的能力较人骨髓MSCs强。结论1、MSCs可以促进单核细胞来源的破骨细胞分化、成熟、存活,增强其骨吸收能力。MSCs表达的细胞表面分子和分泌的多种促进破骨细胞发育的细胞因子是这种促进作用的基础。2、率先报道了在炎性因子TNF-α作用下,MSCs转为抑制破骨细胞的发育和功能。这种转变的部分原因是:MSCs与TNF-α接触后,细胞内p38/MAPK和JNK/SAPK通路活化,抑制破骨细胞的因子OPG分泌增加,从而抑制破骨细胞的发育和功能。以类风湿关节炎病人的关节腔液刺激MSCs也具有相似的抑制作用。给予脂多糖小鼠注射MSCs可以在体内抑制破骨细胞生成。3、与骨髓MSCs相比,RASF-MSCs促进破骨细胞生成的作用更强,提示不同组织来源的MSCs对破骨细胞的调节作用不同。